植物病毒通过降解 Pellino 削弱昆虫载体的 Toll 免疫途径以促进感染，为防控病毒传播提供新思路

《Journal of Virology 4.0》：A plant virus attenuates the Toll immune pathway by degradation of Pellino to facilitate viral infection in insect vectors

这篇研究聚焦水稻条纹病毒（RSV）。研究发现，褐飞虱（Laodelphax striatellus）中的 LsPellino 参与 Toll 免疫途径抑制 RSV 感染。而 RSV 的 NS3 蛋白劫持 LsSOCS5，促使 LsPellino 经 26S 蛋白酶体途径降解，削弱免疫，助力病毒感染，为控制植物病毒传播提供新视角。

　　### 研究背景
Toll 免疫途径在昆虫和哺乳动物中是一条进化上保守的信号通路，当病原体感染果蝇时，受体 Toll 与激活的 Spatzle（Spz）结合，招募 MyD88、Tube 和 Pelle 形成受体近端寡聚复合物，引发一系列反应，调节抗菌肽表达。Pellino 蛋白是高度保守的 E3 泛素连接酶，参与调节 PRR 信号通路，包括 Toll 免疫途径，但在植物病毒通过昆虫载体传播过程中的作用尚不清楚。

水稻条纹病毒（RSV）属于纤细病毒属和 Phenuiviridae 科，是一种非包膜负义 RNA 病毒，给亚洲水稻生产造成严重损失。它由灰飞虱（Laodelphax striatellus）以持久增殖方式传播，感染后会激活灰飞虱的多种免疫信号通路，此前研究发现 Toll 信号通路也参与其中，但 Pellino 是否影响 RSV 传播并不明确。

研究结果

1. LsPellino 的鉴定与特征：通过比对灰飞虱基因组和其他昆虫的 Pellino 基因，鉴定出 LsPellino 基因。其开放阅读框（ORF）包含 1329bp，编码 48.6kDa、442 个氨基酸的蛋白质，含有 FHA 和 RING-like 两个典型功能域。氨基酸序列比对和系统发育分析显示，它与其他飞虱的 Pellino 同源性高。
2. RSV 感染时 LsPellino 表达受抑制：利用 RT-qPCR 检测发现，灰飞虱取食 RSV 感染植株后，LsPellino 转录水平在 1 天和 3 天上调，6 天和 9 天显著下调。在带毒灰飞虱中，LsPellino 在转录和蛋白水平均低于无毒灰飞虱，且在各发育阶段和组织中，带毒个体的表达量都明显降低。免疫荧光标记表明，LsPellino 与 RSV 病毒粒子不共定位，且在感染细胞中的荧光强度显著下降。
3. LsPellino 抑制 RSV 复制和传播：用双链 LsPellino（dsLsPellino）处理带毒灰飞虱，使其 LsPellino 相对转录水平显著降低，同时 RSV 核衣壳蛋白（NP）在 RNA 和蛋白水平的积累增加。用 dsLsPellino 和 RSV 粗提物处理无毒灰飞虱，病毒 RNA 水平显著升高。此外，dsLsPellino 处理的灰飞虱对 RSV 的获取率和传播率更高，感染 RSV 的中肠上皮细胞数量也明显增加，证明 LsPellino 抑制 RSV 复制和传播。
4. E3 泛素连接酶 LsSOCS5 与 LsPellino 相互作用并介导其降解：以 LsPellino 为诱饵蛋白筛选出 72 个潜在相互作用蛋白，酵母双杂交（Y2H）和体内共免疫沉淀（Co-IP）实验证实 E3 泛素连接酶 LsSOCS5 与 LsPellino 相互作用，且 LsSOCS5 特异性结合 LsPellino 的 N 端片段。免疫荧光实验显示二者在灰飞虱唾液腺和中肠细胞共定位。干扰 LsSOCS5 表达后，带毒灰飞虱中 LsPellino 表达增加，病毒 NP 水平下降；用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理带毒灰飞虱，LsPellino 积累增加，病毒 NP 积累减少，表明 26S 蛋白酶体途径参与 RSV 诱导的 LsPellino 降解。
5. RSV 非结构蛋白 NS3 促进 LsSOCS5 介导的 LsPellino 降解：Y2H、pull-down 和 Co-IP 实验表明，RSV 非结构蛋白 NS3（RSV-NS3）与 LsSOCS5、LsPellino 相互作用，且 RSV-NS3 特异性结合 LsPellino 的 N 端片段。免疫荧光显微镜观察发现，RSV-NS3 与 LsSOCS5 或 LsPellino 部分共定位。竞争结合实验显示，RSV-NS3 能稳定 LsSOCS5 和 LsPellino 的相互作用。干扰 NS3 表达后，带毒灰飞虱中 LsPellino 表达显著增加，说明 NS3 促进 LsSOCS5 介导的 LsPellino 降解。
6. LsPellino 降解减弱 Toll 途径介导的抗病毒免疫反应：Y2H 和 pull-down 实验证明，Toll 免疫途径的核心成分 LsTube 与 LsPellino 的 C 端片段特异性相互作用，表明 LsPellino 对 Toll 免疫途径有调节作用。干扰 LsPellino 表达后，用 RSV 粗提物处理无毒灰飞虱，下游免疫相关基因（LsATG3、LsATG8 和 LsATG12）转录水平显著降低；干扰 LsSOCS5 或 NS3 表达后，这些免疫基因表达上调，说明 LsSOCS5 介导的 LsPellino 降解减弱 Toll 途径介导的抗病毒免疫反应。
7. LsPellino 参与其他水稻病毒感染：研究发现，感染水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的灰飞虱中，LsPellino 在转录和蛋白水平均显著降低。干扰 LsPellino 表达后，RBSDV 衣壳蛋白（RB-P10）积累增加。Y2H 和 pull-down 实验显示，RBSDV 的次要核心衣壳蛋白 RB-P8 能与 LsPellino 和 LsSOCS5 结合，表明 LsPellino 参与 RBSDV 感染过程。

研究讨论

本研究揭示了 RSV 新的反防御策略，即 RSV-NS3 劫持 LsSOCS5，通过 26S 蛋白酶体途径促进 LsPellino 降解，削弱 Toll 抗病毒途径，利于病毒在昆虫载体中感染。虽然明确了 LsPellino 通过与 LsTube 相互作用参与 Toll 免疫途径并抑制病毒感染，但仍有诸多问题待探索。例如，LsPellino 的降解是否涉及其他途径，其与 LsTube 的相互作用对 LsCactus 降解和 LsDorsal 磷酸化的影响，以及 LsTube 能否催化 LsPellino 磷酸化并导致其降解等。

已有研究表明，多种病毒通过影响 Pellino 功能逃避宿主抗病毒免疫，本研究中 RSV-NS3 与 LsPellino 的相互作用为后续研究提供方向。此外，RSV 和 RBSDV 感染激活的 JAK-STAT 途径与本研究中的 Toll 途径似乎相互拮抗，病毒如何平衡这些途径以维持感染稳态值得深入研究。同时，不同病毒接种方式对感染和载体适应性的影响，以及多种免疫途径间的相互作用也有待进一步探究。