多重 qPCR 策略与传统显微镜检查相比对肠道原虫诊断的改进：一项为期 3 年对 3500 份粪便样本的前瞻性研究

《Journal of Clinical Microbiology》：Improvement of the diagnosis of intestinal protozoa using a multiplex qPCR strategy compared to classical microscopy: a prospective study on 3,500 stool samples over 3 years

本文通过对 3495 份粪便样本进行前瞻性研究，对比了多重 qPCR（AllPlex Gastrointestinal Panel assay）和显微镜检查对肠道原虫的检测效果。结果显示，多重 qPCR 检测原虫更高效，但显微镜检查在检测特定寄生虫（如 Cystoisospora belli、蠕虫）方面仍有必要。

　　### 肠道原虫感染现状与诊断方法背景
肠道寄生虫在全球范围内广泛存在，土壤传播的蠕虫病是低收入国家的主要热带疾病之一，而肠道原虫在工业化国家也给归国旅行者和免疫功能低下患者带来健康负担。像 Entamoeba histolytica 会引发严重感染，Giardia intestinalis 虽致病性相对较弱，但也可能导致慢性腹泻等问题。

传统的肠道寄生虫诊断依赖显微镜检查，不过该方法需要专业知识，且灵敏度有限。近年来，分子诊断技术尤其是多重实时 PCR（qPCR）检测的商业化，革新了寄生虫检测方式。然而，其分析性能需要在大规模前瞻性研究中与显微镜检查进行对比验证，且针对蠕虫的多重检测较少，价值也不明确。

研究设计与方法

1. 样本选取：从雷恩教学医院寄生虫学实验室信息系统提取 2020 年 1 月 1 日至 2024 年 3 月 15 日的数据，2020 - 2021 年样本用于评估 Blastocystis spp. 和 Dientamoeba fragilis 检测的特异性，2021 年 1 月 1 日至 2024 年 3 月 15 日样本用于评估寄生虫学诊断流程，2020 年样本因疫情期间技术程序修改被排除。
2. 显微镜检查：对样本进行直接湿片检查和两种浓缩方法（浮选法或双相法），由熟练技术人员操作，必要时咨询医学寄生虫学家。
3. 多重 PCR 检测：使用 AllPlex Gastrointestinal Panel（GIP）检测六种原虫（Giardia intestinalis、Cryptosporidium spp.、Entamoeba histolytica、Dientamoeba fragilis、Blastocystis spp.、Cyclospora spp.），包括内部对照，按流程进行 DNA 提取、扩增和结果分析。
4. 单重 qPCR 验证：对 2020 - 2021 年 AllPlex GIP 检测为 Dientamoeba fragilis 或 Blastocystis spp. 阳性的样本，用单重 qPCR 进行验证，必要时重新提取 DNA 并测序。
5. 统计分析：使用 GraphPad 10.2 软件进行统计分析，定量结果用均值 ± 标准差表示，定性结果用百分比和 n/N 表示，采用相应检验方法，α 风险设为 5%。

研究结果

1. AllPlex GIP 检测特异性评估：2020 - 2021 年分析 2502 份粪便样本，Blastocystis spp. 单重 qPCR 在 432 份样本中 96.5% 阳性，最终 99.8% 样本得到确认；Dientamoeba fragilis 单重 qPCR 在 143 份样本中 82.5% 阳性，重新提取后 90.2% 样本得到确认，未确认结果与高 Cq 值相关，表明 AllPlex GIP 检测特异性良好。
2. 显微镜与 AllPlex GIP 性能比较：2021 年 1 月至 2024 年 3 月分析 3495 份粪便样本，来自 2127 名患者。AllPlex GIP 检测到 Giardia intestinalis、Cryptosporidium spp.、Entamoeba histolytica、Dientamoeba fragilis、Blastocystis spp. 的样本比例分别为 1.28%、0.85%、0.25%、8.86%、19.25%；显微镜检测到的比例分别为 0.7%、0.23%、0.68%、0.63%、6.55%。显微镜对部分原虫检测灵敏度低，如对 Giardia intestinalis、Dientamoeba fragilis、Blastocystis spp. 阳性样本的检测率分别仅为 56%、7%、33%。但显微镜能检测到多重检测未涵盖的病原体，如 Cystoisospora belli，还能发现非致病性原虫和蠕虫。同时，肠道原虫感染存在多种伴生情况，如 Blastocystis - 阳性 qPCR 常与其他寄生虫共感染。

讨论

1. 诊断技术选择：显微镜检查可检测所有病原体，但分子检测仅针对有限寄生虫。对于蠕虫病诊断，显微镜更适用；对于原虫感染，分子方法可检测储存样本中的寄生虫 DNA，Allplex GIP 能检测多数致病性原虫，但不包括 Cystoisospora belli 和 Balantioides coli。
2. AllPlex GIP 优势：使用 AllPlex GIP 能诊断更多阳性样本，如对 Cryptosporidium 感染、giardiasis 和 amoebiasis 的诊断有重要价值，还可区分 E. dispar 和 E. histolytica，避免不必要治疗。
3. 争议原虫分析：qPCR 检测 Dientamoeba fragilis 和 Blastocystis spp. 频率高于显微镜，并非 qPCR 特异性不足，而是显微镜检测存在困难。这两种原虫在疾病中的作用仍有争议，其与肠道疾病的关系需进一步研究，qPCR 有助于收集更多流行病学数据。
4. 其他发现：Cryptosporidium spp. 和 Cystoisospora belli 常作为单一寄生虫被检测到，意义有待明确。

研究结论

AllPlex GIP 在检测多数原虫寄生虫方面高效，适合显微镜检查技术有限的实验室，但需做好质量控制。对于临床症状持续或免疫缺陷患者，应采用补充技术检测特定寄生虫；怀疑蠕虫病时，需结合合适方法检测虫卵或幼虫。分子检测的高特异性也促使重新审视 Blastocystis spp. 和 Dientamoeba fragilis 的流行病学和致病性。