浮游动物庇护病毒免受阳光灭活：对水质及公共健康的关键影响

《Applied and Environmental Microbiology》：Zooplankton protect viruses from sunlight disinfection

本文研究了浮游动物（枝角类褶皱臂尾轮虫，Branchionus plicatilis）对肠道病毒（MS2 噬菌体）阳光灭活的影响。发现轮虫可通过滤食摄取病毒并保护其免受阳光灭活，这对准确评估自然水体中病毒的灭活及改进现有模型意义重大。

　　### 研究背景
在水生系统中，肠道病毒污染是全球水传播疾病爆发的主要原因之一。阳光介导的消毒是自然水体中肠道病毒灭活的重要过程，包括直接和间接的内源性、外源性灭活。但这一过程受水质、太阳辐射等多种因素影响，且当前考虑非生物机制的阳光灭活模型忽略了生物机制，无法准确预测病毒的灭活情况。

与大量研究非生物因素不同，生物机制与阳光消毒的相互作用研究较少。浮游动物在自然系统中作用关键，虽已知其能灭活细菌，但与病毒的相互作用尚不明确。有研究表明浮游动物可减少病毒浓度，但阳光对这种相互作用的影响未知，且浮游动物对病毒消毒的保护作用也缺乏量化研究。

本研究选用褶皱臂尾轮虫（Branchionus plicatilis）作为模式浮游动物，因其分布广泛、繁殖力强且耐受性好，研究结果可能适用于其他浮游动物；选用 MS2 噬菌体作为模式病毒，因其常被用作保守模型病毒，研究结果可推广到肠道病毒灭活。

材料与方法

1. 轮虫培养与实验准备：将褶皱臂尾轮虫在 15 ppt 咸水（含 Instant Ocean Salt 的 MilliQ 水）中，20°C 下培养，投喂Nannochloropsis sp藻类。实验前，将轮虫从 20°C 驯化至 15°C，计数并稀释至约 200 只 /mL。
2. MS2 繁殖与计数：MS2 在Escherichia coli F_amp宿主中繁殖，经氯仿裂解、离心、过滤等步骤纯化，采用双层琼脂覆盖（DAL）法检测噬菌体数量，结果以每毫升噬菌斑形成单位（PFU/mL）记录。
3. 轮虫与 MS2 共培养实验：设置含轮虫（180 ± 30 只 /mL）和不含轮虫的实验烧杯，加入 MS2 使其初始滴度约为 10⁶ PFU/mL，每天投喂藻类。每隔 24 小时取样过滤，检测 MS2 数量，实验持续 120 小时。
4. 阳光照射实验
   • 实验室外设置：实验在马萨诸塞州某建筑顶层进行 9.5 小时。微宇宙实验装置置于 15°C 水浴中，通过循环冷水控温，用化学 actinometry 测量溶液吸收的光。实验过程中记录水温、光照强度等数据。
   • 活轮虫实验设置：设置含活轮虫（分为预暴露于 MS2 的 primed 轮虫和未预暴露的 na?ve 轮虫）、阳光照射对照、黑暗对照的实验组。
   • 死轮虫实验设置：将轮虫冷冻后解冻制备死轮虫，设置含活 na?ve 轮虫、死轮虫、无轮虫的阳光照射实验组和相应黑暗对照组。
   
   
5. 轮虫组织分析：将轮虫过筛、冲洗、离心后，研磨组织并稀释涂布，测定轮虫组织中 MS2 浓度。
6. 化学 actinometry：制备 p - 硝基苯甲醚（PNA）和吡啶（pyr）化学 actinometer，在实验过程中每隔 45 分钟取样，用高效液相色谱（HPLC）分析，结合分光光度计测量的通量值计算光吸收。
7. 数据分析：使用 SPSS（v28）进行统计分析。计算轮虫对病毒的摄取率（k）、净摄取率（k_net）、净对数去除率等；基于一级衰减模型计算阳光照射实验中病毒的灭活速率常数（k和κ），并对数据进行方差分析（ANOVA）、协方差分析（ANCOVA）和 Spearman 秩相关检验。

结果与讨论

1. 轮虫通过滤食从溶液中去除病毒：轮虫与 MS2 共培养 120 小时，平均净对数去除率为 2.6 ± 0.08。不同批次轮虫实验的净对数去除率无显著差异，轮虫浓度与对数去除值无显著关系。本研究首次量化轮虫对 MS2 的摄取率，虽无法与其他研究直接比较，但轮虫对 MS2 的摄取表明其可影响水质和微生物群落。
2. 轮虫摄取病毒有助于保护病毒免受阳光灭活：不含轮虫的对照组 MS2 灭活速率常数（k = 1.3 ± 0.07 hr^?1或κ = 0.058 ± 0.02 m² kJ^?1）受多种因素影响。与不含轮虫的对照组相比，有活轮虫存在时，病毒在阳光下的灭活显著减少。primed 轮虫和 na?ve 轮虫都能显著保护 MS2 免受阳光灭活，但二者保护效果的差异需进一步研究。
3. 死轮虫对病毒免受阳光灭活的保护作用明显弱于活轮虫：死轮虫虽能提供一定保护，但不如活轮虫明显。活轮虫的生物活性对保护病毒免受阳光灭活贡献更大，其原因可能与轮虫的过滤、摄取和排泄行为有关，且轮虫肠道内的病毒可能受到保护并被重新释放到系统中。
4. 轮虫不能完全灭活摄取的病毒：从轮虫组织中可提取出活病毒，且轮虫在黑暗和光照条件下都保留一定量病毒，但光照下病毒浓度显著降低。na?ve 轮虫和 primed 轮虫的病毒组织载量相似，可能与轮虫的清除率和肠道保留时间有关。
5. 环境意义：轮虫作为滤食性生物，在自然和人工水生系统中作用重要。本研究表明轮虫可能成为病毒的载体，限制阳光灭活，促进病毒传播。未来需进一步研究不同水基质和病毒类型下轮虫对水质的影响，以及轮虫保护病毒的机制，并开展多浮游动物物种研究，以更好地理解水生生态系统中的复杂相互作用。