土壤原生生物接种：身份、时机对植物生长的影响及与根际微生物群落的关联

《Applied and Environmental Microbiology》：Identity and timing of protist inoculation affect plant performance largely irrespective of changes in the rhizosphere microbial community

本文聚焦土壤食细菌原生生物，研究其接种身份、多样性和时间对植物发育及根际微生物组组装的影响。发现早期接种能最大程度增加植物地上生物量，单种和混合接种对植物发育影响相似且对原核生物群落组成影响较小，为农业应用提供参考。

　　### 研究背景
土壤中的捕食性原生生物数量众多且种类丰富，在陆地生态系统中扮演着重要角色。它们是细菌的主要捕食者，其捕食活动对植物生长有着多方面的影响。一方面，原生生物通过捕食细菌，将细菌生物量中的营养物质释放出来，从而为植物提供更多的养分；另一方面，它们还能改变土壤细菌群落的组成结构。已有研究表明，原生生物的应用可以增加植物地上部分的生物量，让植物的根系统更加发达，还能提高植物体内氮等元素的浓度。此外，原生生物还能促进对植物有益的细菌类群的生长。

然而，目前仍存在许多未知之处。不同的原生生物类群在食物偏好上差异很大，这会导致它们对土壤细菌群落产生不同的捕食影响，进而影响植物与相关微生物群落之间的复杂相互作用。但我们还无法根据原生生物的形态、系统发育、生理或功能等特征来预测其对特定细菌群落的捕食影响。而且，以往研究通常只关注原生生物接种的一个时间点，忽略了接种时间对其效果的重要影响。实际上，接种时间可能会极大地影响原生生物的效果，因为从接种到其发挥显著的捕食作用需要一定时间，同时植物自身对根际群落组成的影响也会随着时间而变化。此外，多种原生生物混合接种是否比单一原生生物接种更能有效改善植物性能也有待研究。

基于这些知识空白，本研究旨在探究以下几个关键问题：不同原生生物物种对植物性能的个体影响；接种的最佳时间；单一物种与混合物种接种的效果差异。

材料与方法

1. 原生生物分离与准备：从荷兰的多种环境（如沙质土壤和生长基质）中分离出原生生物。具体操作是将 1g 土壤样品悬浮在 20mL Page's Amoeba Saline（PAS）中，经过振荡、筛选等步骤获得纯净的原生生物菌株，并在 15°C 下用新鲜的大肠杆菌 OP50 进行培养。实验选取了六个具有代表性的原生生物分离株，包括不同的谱系（Amorphea、TSAR 和 “Excavates”）和形态类型（三个变形虫状、两个变形鞭毛虫状、一个鞭毛虫状）。后续实验又选择了 Cercomonas sp. S24D2，并将其与另外两种具有不同摄食模式的原生生物（Acanthamoeba sp. C13D2 和异叶足虫分离株 S18D10）混合，用于测试接种时间和单种与混合接种的效果。在应用前，对原生生物进行清洗、离心和计数，并调整其密度至 1.3×10⁴ - 1.5×10⁴ ind./mL。
2. 实验设置
   • 第一个实验：测试单个原生生物分离株的影响：在生长室中进行盆栽实验，以生菜（Lactuca sativa）为模型作物，每个处理设置 13 个重复。实验所用土壤经过灭菌处理，去除原生生物，以聚焦接种的特定原生生物分离株的影响。实验步骤包括制备半自然的无原生生物微生物群落，将其接种到盆栽土壤中，然后在不同处理组中分别接种不同的原生生物分离株或作为对照，21 天后移栽生菜幼苗，再过 21 天进行收获，测定植物的生长指标（如根表面积、地上和地下部分干重等）和土壤微生物群落特征（通过 16S rRNA 基因扩增子测序分析）。
   • 第二个实验：测试接种时间和单种与混合物种接种的影响：在温室中进行实验，采用两因素设计，因素包括接种时间（植物移栽前 7 天、移栽时、移栽后 7 天）和接种类型（单种 Cercomonas sp. S24D2 和混合种 Cercomonas sp. S24D2、Acanthamoeba sp. C13D2 和异叶足虫分离株 S18D10），每个处理设置 12 个重复。实验土壤为非灭菌土壤，在接种原生生物和移栽生菜幼苗后，经过 30 天进行收获，测定植物的鲜重、干重、营养元素含量等指标，同时对根际土壤微生物群落进行分析（包括 16S 和 18S rRNA 基因扩增子测序）。
   
   
3. 植物营养测量：采用特定的方法对植物样品进行处理，用于测量植物中的多种营养元素含量。对于 ICP - AES 分析，将干燥、研磨后的植物地上部分样品经过灰化、酸消解等步骤，然后用 ICP - AES 光谱仪测定 Al、Ca、Cd、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、Pb、S 和 Zn 等元素的含量，并将结果转换为每株植物的含量（mg/plant）。对于碳和氮含量的测量，使用元素分析仪，将一定量的干燥、研磨后的植物地上或地下部分样品进行分析，计算出碳和氮的相对含量（% per plant）、绝对含量（mg/plant）以及 C:N 比。
4. 土壤微生物群落分析：从接种前的原始土壤和收获时的根际土壤样品中提取 DNA，使用 DNeasy PowerSoil 试剂盒，并对提取步骤进行了优化以提高产量。通过实时荧光定量 PCR（qPCR）对原核生物群落的丰度进行估计，以 16S rRNA 基因的 V4 区域为靶点。利用高通量 16S 和 18S rRNA 基因扩增子测序分析原核生物和真核生物群落结构，测序工作由 Genome Quebec 完成。对测序数据进行质量控制和分析，使用 QIIME2 和 R 软件进行处理，包括去除低质量序列、分配分类学信息、计算多样性指数等。
5. 数据分析：使用 R 软件进行所有数据分析。对于不同的实验处理，分别进行相应的统计分析。在第一个实验中，通过顺序双向方差分析（ANOVA）研究原生生物处理对植物生长指标（如总干生物量、地上和地下部分干重、根表面积等）、营养元素含量以及原核生物群落特征（如丰度、物种丰富度、均匀度和群落组成）的影响，若 ANOVA 结果显著，则进行 Tukey 事后检验。在第二个实验中，同样使用双向 ANOVA 分析接种时间、接种类型以及植物健康状况对植物生长指标、营养元素含量、微生物群落特征（包括原核生物和原生生物的丰度、多样性指数和群落组成）的影响，若有显著结果则进行 Tukey 事后检验。此外，还进行了相关性分析，研究微生物群落变化与植物属性之间的潜在关系。

实验结果

1. 初始土壤细菌条件：两个实验设置的初始土壤细菌群落具有相似的观察到的物种丰富度和平均细菌丰度，但组成有所不同。在第一个实验设置中，Proteobacteria 和 Actinobacteria 占总读数的 75% 以上；而在第二个实验设置中，除了这两个门之外，Chloroflexi 和 Firmicutes 也有较高的相对丰度，门水平上的均匀度更高。
2. 单个原生生物分离株的影响：在植物生长方面，虽然原生生物处理对总生物量、地上和地下部分干重没有显著影响，但 Vannella sp. P147 和 Cercomonas sp. S24D2 处理显著增加了地上部分与地下部分的干重比，同时这两个处理还呈现出根表面积减小的趋势。在原核生物群落结构方面，不同原生生物处理在收获时对根际土壤中的原核生物群落有不同影响。Vannella sp. P33 和 Cercomonas sp. S24D2 处理增加了原核生物物种丰富度，而 Allovahlkampfia sp. NL10 处理则降低了物种丰富度。基于 Bray - Curtis 相异度的分析显示，Vannella sp. P33 和 Cercomonas sp. S24D2 处理的群落与对照组以及其他一些处理组的群落存在显著差异。
3. 接种时间和单种与混合物种接种的影响：疾病患病率与植物的许多性状增加相关，可能是由于疾病在处理组中的分布所致。接种时间对植物地上部分的属性有显著影响，早期接种（移栽前 1 周）导致地上生物量和营养元素含量增加最多。相比之下，接种类型（单种或混合种）仅显著增加了地上部分与地下部分的干重比，且未观察到接种时间和接种类型之间的显著相互作用。在微生物群落方面，接种对原核生物群落的影响较小，仅略微降低了原核生物的 alpha 多样性，且对原核生物群落结构没有显著影响。对于原生生物群落，仅接种时间对其组成有显著影响。通过成对差异丰度分析发现，不同处理与对照组相比，特定细菌属的相对丰度存在显著变化，且单种接种比混合种接种影响的细菌属更多，但没有发现原生生物属的显著富集或消耗。此外，通过相关性分析发现，原核生物群落的变化与植物生长呈正相关，而原生生物群落的变化与植物生长呈负相关，同时还确定了一些与植物属性相关的细菌和原生生物属。

讨论

1. 原生生物身份的影响：原生生物接种对植物属性和根际原核生物群落的影响取决于原生生物的身份。在本研究中，虽然观察到一些影响，但与之前的研究相比，对植物属性的影响相对较小。例如，Vannella sp. P147 和 Cercomonas sp. S24D2 显著增加了地上部分与地下部分的干重比，主要是由于根表面积减小，这与以往报道的原生生物通常促进根系更发达的结果不同。这种差异可能是由于不同研究中使用的原生生物分离株不同，它们具有不同的特征和摄食模式。在原核生物群落方面，不同原生生物对其物种丰富度和群落组成有不同影响，如 Cercomonas sp. S24D2 和 Vannella sp. P33 增加了物种丰富度，而 Allovahlkampfia sp. NL10 降低了物种丰富度，这表明原生生物的捕食影响可能因其摄食生态位的广度而异。
2. 接种时间的影响：早期接种（移栽前 1 周）对植物地上生物量的增加效果最为显著，这与之前的一些研究结果一致。然而，与预期相反，接种时间对土壤微生物群落组成的影响较小，可能是因为植物自身对根际群落组成的影响更为主导，随着时间推移，捕食者的影响被植物的影响所削弱。但有趣的是，晚期接种处理与对照组相比，原生生物群落组成发生了明显变化，这表明原生生物群落可能对环境变化或农业实践更为敏感。
3. 单种与混合物种接种的影响：与假设和之前的研究不同，本研究中三种物种混合接种并没有比单种接种对植物性能产生更好的效果，仅在地上部分与地下部分的干重比上表现出差异。这可能是因为生物多样性效应高度依赖于环境背景，在本研究的条件下，单一的 Cercomonas sp. 分离株可能比其他两种原生生物更具竞争力，导致单种和混合接种对猎物群落的捕食影响相似。此外，混合物种中捕食者之间的竞争可能会降低每个物种的捕食影响，使得单种接种影响的细菌属更多。
4. 微生物群落与植物属性的关系：虽然接种对微生物群落的影响较小，但仍发现原核生物群落的变化与植物生长呈正相关，而原生生物群落的变化与植物生长呈负相关。这表明原核生物群落组成的改变可能对植物有益，而优势原生生物群落的稳定组成也可能对植物有积极影响。同时，还确定了一些与植物属性相关的细菌和原生生物属，其中一些细菌属是已知的对植物有益的微生物，而另一些则有待进一步研究其与植物的关系。例如，Sphingopyxis 在单种接种（移栽前 1 周）中数量减少，它之前被认为是食细菌捕食者的良好食物来源。此外，还发现了一些原生生物属与植物中镉含量的正相关关系，这是一个新的发现，需要进一步研究。

研究结论

本研究表明，原生生物对植物属性和土壤微生物群落组成具有菌株特异性的影响，早期原生生物接种对植物生物量的增加最为有效，而引入的原生生物的生物多样性在本实验系统中作用较小。虽然原生生物接种对根际微生物群落没有重大的长期影响，但仍能检测到特定分类群的响应。本研究为理解原生生物捕食者、细菌猎物和植物属性之间的关系提供了一定的见解，但还需要进一步扩展研究，以充分确定多营养级相互作用在植物健康和发育中的作用，为将原生生物纳入可持续植物生产策略提供科学依据。