高度有效的喹喔啉二酮抑制 α- 溶血素并改善金黄色葡萄球菌肺部感染：新型抗感染策略的重大突破

《Cell Host & Microbe》：Highly potent quinoxalinediones inhibit α-hemolysin and ameliorate Staphylococcus aureus lung infections

本文聚焦金黄色葡萄球菌（S. aureus）引发的医院获得性肺炎，该疾病死亡率高且现有抗生素治疗效果不佳。研究发现喹喔啉二酮（QDS）能强效抑制 α- 溶血素（Hla），通过多种实验验证其在细胞和动物模型中的有效性，为治疗相关感染提供新方向，极具研究价值。

　　

研究背景

金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种革兰氏阳性人类共生致病菌，可引发多种严重感染，如皮肤、软组织、肺部感染，以及血流感染、心内膜炎和骨髓炎等 。其中，由其引起的医院获得性肺炎，因高患病率、高死亡率以及对大量医疗资源的消耗，成为严峻的临床挑战。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的出现，进一步削弱了常用抗生素的治疗效果，即便使用达到最低抑菌浓度（MICs）的抗生素，治疗失败率依旧居高不下。

α- 溶血素（Hla）是金黄色葡萄球菌的主要致病因子，它以单体形式分泌，与宿主细胞受体结合后，寡聚化为 232-kDa 的七聚体，进而在细胞膜上形成孔道，导致细胞内容物泄漏和细胞裂解 。Hla 不仅对多种细胞具有细胞毒性，还能在亚裂解浓度下加剧炎症反应，破坏内皮和上皮屏障的完整性，促进其他病原体的共感染。大量研究表明，抑制 Hla 的功能可改善感染结局，因此 Hla 被视为极具潜力的药物靶点，针对它的治疗策略有望为金黄色葡萄球菌感染的治疗带来新突破。

研究目的

本研究旨在寻找能够有效抑制 Hla 的小分子化合物，开发出一种新型的治疗策略，以应对金黄色葡萄球菌感染，尤其是肺部感染。与单克隆抗体相比，小分子抑制剂具有成本低、能快速在肺部达到有效浓度等优势。研究团队期望通过筛选和优化，找到高效、安全且具有良好药代动力学（PK）性质的小分子抑制剂，为临床治疗提供新的选择。

研究方法

1. 建立细胞模型与高通量筛选：利用 Hla 诱导细胞内钙离子浓度升高这一特性，开发了一种适用于高通量筛选的小型化检测方法。以人白细胞细胞系 U937 为模型，将该检测方法微型化并自动化至 1,536 孔板格式，检测了超过 182,000 种化合物。筛选出具有喹喔啉二酮（QDS）结构的活性化合物，其中化合物 1 的半最大有效浓度（EC₅₀）为 0.34 μM，且该化合物无细胞毒性，水溶性良好，代谢稳定，因此被选为优化的先导化合物系列。
2. 优化 QDS 抑制剂：通过合成一系列含有羧酰胺或磺酰胺基团的化合物，研究人员发现磺酰胺类化合物的活性普遍优于羧酰胺类。较短烷基链的磺酰胺表现出更高的活性，磺酰胺基团的 NH 对活性至关重要，其烷基化会导致活性丧失。此外，在 QDS 支架的 7 位引入甲基可显著提高活性。经过一系列优化，确定了以 H831 和 H052 为代表的高效 Hla 抑制剂的关键结构特征，即 QDS 核心，7 位甲基取代，6 位芳基化磺酰胺取代。
3. 细胞模型实验：使用多种细胞类型，包括原代人小气道上皮细胞（HSAEpCs）、肺微血管内皮细胞（HPMECs）、单核细胞、小鼠 Th1 细胞和兔红细胞等，评估 QDS 对 Hla 诱导损伤的保护作用。实验涵盖了钙内流、细胞毒性、溶血、细胞单层完整性和粘附连接等多个方面，通过多种检测方法，如 Fluo-4 NW 钙检测试剂盒检测钙内流、多毒素荧光多重细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性、监测血红蛋白释放检测溶血等，全面探究 QDS 的作用效果。
4. 作用机制研究：采用时间添加实验、单通道电生理学实验、化学蛋白质组学和核磁共振（NMR）实验等多种技术，深入研究 QDS 的作用机制。时间添加实验表明，QDS 在 Hla 添加前加入能更有效地抑制钙内流；单通道电生理学实验证实 QDS 可阻止功能性孔的形成；化学蛋白质组学和 NMR 实验发现 QDS 主要与 Hla 的 W286 和 Y54 氨基酸结合，该结合位点靠近磷脂结合位点，从而抑制 Hla 的功能。
5. 药代动力学研究与动物实验：对 H052 和 H831 进行药代动力学研究，评估它们在肝脏微粒体、血浆中的稳定性，以及在 CaCo-2 细胞中的渗透性。通过给 CD-1 小鼠静脉注射、皮下注射、腹腔注射和口服给药，测定药物在血浆、肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的浓度。同时，利用 C57BL/6 小鼠建立金黄色葡萄球菌肺部感染模型，评估 H052 的体内疗效，包括生存率、细菌载量和炎症指标等。

研究结果

1. QDS 对 Hla 诱导损伤的保护作用：QDS 抑制剂 H831 和 H052 在多种细胞模型中表现出显著的保护作用。它们能有效抑制 Hla 诱导的钙内流，在 CD14⁺单核细胞和肺内皮细胞中，H831 和 H052 的 EC₅₀值分别低至 30 nM 和 110 nM（H831）、90 nM 和 830 nM（H052） 。在细胞毒性实验中，H831 和 H052 能抑制 Hla 诱导的细胞死亡，如在 A549 肺上皮细胞中，它们可抑制乳酸脱氢酶（LDH）的释放，EC₅₀值分别为 0.002 μM 和 0.04 μM 。此外，QDS 还能抑制 Hla 诱导的溶血，在兔红细胞实验中，H831 和 H052 抑制溶血的 EC₅₀值分别为 0.33 μM 和 0.79 μM 。在细胞单层完整性和粘附连接实验中，QDS 能有效阻止 Hla 对细胞单层的破坏，维持细胞间的紧密连接，如在人微血管肺内皮细胞实验中，H831 和 H052 抑制 Hla 诱导的阻抗下降的 EC₅₀值分别为 0.20 μM 和 0.98 μM 。
2. 对不同 Hla 亚型的有效性：通过生物信息分析确定了 13 种主要的 Hla 亚型，这些亚型覆盖了 79% 的已发表临床分离株。实验表明，H052（EC₅₀=9 - 45 nM）和 H831（EC₅₀=4 - 95 nM）对所有亚型均能有效抑制钙内流，证明 QDS 可广泛应用于覆盖所有流行的临床 Hla 序列变体。
3. 作用机制：一系列实验表明，QDS 通过直接与 Hla 结合来阻止功能性孔的形成。QDS 与 Hla 的结合位点主要在 W286 和 Y54 氨基酸附近，该区域靠近磷脂结合位点，可能影响 Hla 的七聚化过程，从而抑制其功能。虽然也发现了一些潜在的次要靶点，但它们对 QDS 的高活性贡献较小，且 QDS 对细胞内靶点的作用因低细胞渗透性而受到限制。
4. 药代动力学性质与体内疗效：H052 和 H831 在肝脏微粒体和血浆中稳定，在 CaCo-2 细胞中的渗透性较低。在 CD-1 小鼠的药代动力学研究中，H052 在肺组织和 BALF 中的浓度较高，且在体内具有良好的耐受性。在 C57BL/6 小鼠的肺部感染模型中，H052 表现出显著的疗效。预防性给予 H052 可显著降低感染后 24 小时肺内的细菌载量，从 9.5±0.11（载体对照）降至 6.48±0.54 CFU/g，同时降低促炎细胞因子白细胞介素 - 6（IL-6）的水平，从 4,325±2,876 pg/mL 降至 899±990 pg/mL 。此外，H052 与利奈唑胺（LZD）联合使用，可显著提高感染小鼠的生存率，即使在 LZD 剂量降低的情况下，联合治疗仍能使生存率恢复到 90%，而预先给予 H052 可使生存率达到 100% 。

研究结论

本研究成功发现并优化了喹喔啉二酮（QDS）作为高效的 Hla 小分子抑制剂。QDS 能够有效抑制 Hla 的功能，逆转 Hla 诱导的致病性特征，如钙内流、细胞毒性、溶血和单层破坏等 。其作用机制主要是通过直接与 Hla 单体结合，阻止功能性孔的形成。H052 在体内具有良好的药代动力学性质和耐受性，在金黄色葡萄球菌肺部感染模型中表现出显著的疗效，无论是作为单一疗法还是与抗生素联合使用，都能有效提高感染小鼠的生存率，降低细菌载量和炎症指标。这些结果表明，QDS 作为一种新型的抗感染药物，具有巨大的临床应用潜力，为治疗金黄色葡萄球菌感染，尤其是肺部感染，提供了新的策略和希望。同时，该研究也为针对其他细菌毒素的小分子药物研发提供了重要的参考和借鉴。