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本文聚焦于噬菌体（phage）研究，发现 Chimalliviridae 科噬菌体感染宿主细胞时，会先后形成早期噬菌体感染（EPI）囊泡和噬菌体细胞核。EPI 囊泡转录活跃，噬菌体细胞核对基因组复制至关重要，二者协作推动病毒生命周期，为理解噬菌体感染机制提供新视角。
### 研究背景
许多真核病毒需借助膜结合的区室进行复制，然而此前人们并不清楚原核病毒是否也能形成类似的细胞器。Chimalliviridae 科（chimalliviruses）的噬菌体在感染过程中，会构建一种蛋白质结构的噬菌体细胞核，其基因组在其中进行复制 。该噬菌体细胞核由病毒编码的蛋白质 chimallin（ChmA）构成的连续二维晶格所包围，能够保护复制中的噬菌体基因组免受宿主防御机制，如 DNA 靶向的 CRISPR-Cas 系统和限制酶的攻击。此前研究观察到感染细胞内存在类似含 DNA 的膜结合囊泡，但它们在噬菌体生命周期中的作用尚不明确，且噬菌体基因组在噬菌体细胞核组装前如何免受宿主防御的保护也不清楚。
实验设计
- 观察感染早期囊泡形成：通过冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）观察野生型（WT）Goslar 感染大肠杆菌（E. coli）后 1 分钟（mpi）的细胞，确定囊泡是否在感染早期形成；利用细胞可渗透的膜染色剂 MitoTracker Green FM（MTG）和 DNA 染色剂 DAPI 进行荧光显微镜观察，追踪囊泡与 DNA 的共定位情况；构建携带 gp58-sfGFP 的 Goslar 子代噬菌体，确认早期观察到的 DNA 焦点是否为注入的噬菌体基因组。
- 研究噬菌体细胞核的作用：运用 CRISPR 干扰通过反义 RNA 靶向（CRISPRi-ART）技术，抑制主要核壳蛋白 ChmA 的产生，从而阻止噬菌体细胞核的组装；通过蛋白质免疫印迹（western blot）检测 ChmA 的表达水平；采用噬菌斑实验（plaque assay）比较 Goslar 在正常菌株和 ChmA 敲低菌株中的复制能力；借助时间推移明场显微镜观察感染进程。
- 探究囊泡阶段病毒基因组状态：对感染的对照菌株和 ChmA 敲低菌株进行荧光显微镜成像，对比 DNA 焦点的特征；通过定量 PCR（qPCR）测量噬菌体 DNA 的含量；利用 cryo-ET 观察 ChmA 敲低时感染细胞内的囊泡。
- 分析 EPI 囊泡的转录活性：观察囊泡表面是否存在多核糖体，判断其转录活性；感染携带 sfGFP 标记的 vRNAP 亚基 gp196（sfGFP-vRNAP）的 Goslar，研究转录机器与噬菌体 DNA 的共定位情况；运用 RNA 测序（RNA-seq）技术，比较不同感染条件下的病毒转录组。
- 研究噬菌体基因组的转移过程：使用 MTG、DAPI 和 mCherry 标记的 ChmA，通过荧光显微镜观察噬菌体 DNA、EPI 囊泡膜和噬菌体细胞核之间的空间关系；利用时间推移显微镜观察 EPI 囊泡是否随噬菌体细胞核旋转。
实验结果
- 膜结合、含 DNA 的囊泡在 Goslar 感染早期形成：cryo-ET 显示，感染 1 mpi 时，大肠杆菌细胞内出现平均直径为 189.9 nm 的膜结合囊泡，且缺乏核糖体，内部似乎含有 DNA。荧光显微镜观察发现，MTG 染色的囊泡在感染早期与 DAPI 染色的 DNA 共定位，随着感染进程，共定位比例逐渐下降，到感染后期，多数囊泡与 DNA 或噬菌体细胞核相邻。携带 gp58-sfGFP 的 Goslar 子代噬菌体实验证实，早期观察到的 DNA 焦点确实是注入的噬菌体基因组。
- 噬菌体细胞核对病毒繁殖至关重要：CRISPRi-ART 成功抑制 ChmA 表达，ChmAg1 和 ChmAg2 这两种靶向 ChmA 转录本的向导 RNA 分别使 ChmA 表达降低 91.5% 和 79.8%。噬菌斑实验表明，Goslar 在 ChmA 敲低菌株中形成噬菌斑的能力比对照菌株降低了至少 10000 倍，补充表达 ChmA 后，噬菌斑形成能力显著恢复。时间推移明场显微镜观察发现，ChmA 敲低时，感染在 150 mpi 仍未继续，感染细胞保持完整且未形成可见的噬菌体细胞核。
- 囊泡中的病毒基因组无法进行 DNA 复制：ChmA 敲低时，感染细胞虽出现肿胀和伸长，但几乎不形成成熟的噬菌体细胞核，而是含有被 MTG 染色的膜焦点包围的 DAPI 染色 DNA 焦点，这些焦点与早期感染时的 DNA 焦点相似，且与注入的蛋白质 gp58 相关。qPCR 结果显示，对照细胞中噬菌体 DNA 含量在 30 - 60 mpi 显著增加，而 ChmA 敲低细胞中的噬菌体 DNA 含量在此期间无变化。cryo-ET 观察到 ChmA 敲低时，感染细胞内的囊泡在 30 mpi 和 90 mpi 时大小与早期 WT 感染时形成的囊泡相同，均约为 190 nm。
- EPI 囊泡具有转录活性：在 ChmA 敲低细胞的囊泡表面观察到含有至少 10 个核糖体的多核糖体，表明囊泡具有转录活性。感染携带 sfGFP-vRNAP 的 Goslar 后，在对照菌株和 ChmA 敲低菌株中，多数细胞内的 sfGFP-vRNAP 焦点都与噬菌体 DNA 相关，证实囊泡携带早期基因表达所需的转录机器。RNA-seq 结果显示，ChmA 敲低菌株在 30 mpi 时的病毒转录组与早期 WT 感染时的转录组高度匹配，许多早期基因在 ChmA 敲低时正常转录，而后期基因转录显著减少。蛋白质免疫印迹结果与转录水平变化相符，如 PicA 蛋白表达水平与对照相似，而 Goslar 的 RecA 同源物（gp193）转录水平大幅降低，蛋白几乎检测不到。
- 噬菌体基因组从囊泡转移到噬菌体细胞核：在感染后期（60 mpi），EPI 囊泡膜及其内部的蛋白质（如 gp58 和 vRNAP）仍与噬菌体细胞核表面相关，且多数囊泡不再含有 DNA，表明噬菌体基因组从 EPI 囊泡转移到了噬菌体细胞核。荧光显微镜观察发现，随着感染时间推移，噬菌体 DNA 从 MTG 染色的 EPI 囊泡转移到 mCherry-ChmA 标记的噬菌体细胞核中。时间推移显微镜观察到，EPI 囊泡（以 gp58-sfGFP 标记）会随着噬菌体细胞核的旋转而旋转，证实 EPI 囊泡与噬菌体细胞核表面相连。
研究结论
本研究揭示了 Chimalliviridae 科噬菌体感染过程中，存在一个此前未知的早期阶段 ——EPI 囊泡阶段。噬菌体基因组最初被注入到由宿主内膜形成的 EPI 囊泡中，EPI 囊泡含有 vRNAP，具有转录活性，可表达早期噬菌体基因。转录产生的 mRNA 被输出到细胞质中进行翻译，合成的蛋白质包括 ChmA、PicA 和 ChmC 等，这些蛋白质参与噬菌体细胞核的组装、蛋白质导入和 mRNA 输出等过程。随后，噬菌体基因组通过未知机制转移到新形成的噬菌体细胞核中，在噬菌体细胞核中进行第二轮基因表达和 DNA 复制。若 ChmA 缺失，感染会停滞在 EPI 囊泡阶段，只能表达病毒转录程序的第一阶段。本研究还表明，噬菌体细胞核对病毒生命周期的进展至关重要，它不仅能保护病毒基因组免受宿主防御，还对第二阶段的转录程序和 DNA 复制不可或缺。此外，EPI 囊泡是原核细胞中首个被发现的将基因组及其转录与细胞质中的翻译完全分离的膜结合区室，这一发现为理解病毒与宿主的相互作用提供了新的视角，也表明在噬菌体 - 宿主的进化军备竞赛中，形成了两个不同的区室来保护 Chimalliviridae 病毒的 DNA。未来研究可进一步探索 EPI 囊泡形成和基因组转移的精确机制，以及 EPI 囊泡在基因组转移后的命运。
