创新技术解锁 EBV 基因组密码：助力伯基特淋巴瘤研究新突破

《Scientific Reports》：Comparison of nanopore with illumina whole genome assemblies of the Epstein-Barr virus in Burkitt lymphoma

为解决 EBV（Epstein-Barr 病毒）变异与伯基特淋巴瘤（BL）相关肿瘤发生关系不明，及缺乏高效低成本病毒全基因组测序方法的问题，研究人员开展了 EBV 全基因组测序研究。他们优化方法后对细胞系和患者肿瘤测序，结果显示新方法高效准确，有助于深入理解 EBV 变异与 BL 的关系。

　　在医学研究的广阔领域中，伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）一直是备受关注的焦点。自 1958 年丹尼斯?伯基特医生发现这种独特的肿瘤以来，它便吸引了无数科研人员的目光。1964 年，爱泼斯坦 - 巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在 BL 肿瘤细胞中的发现，更是为研究开启了新的篇章，EBV 成为首个被发现的人类致癌病毒，BL 也成为第一种与病毒相关的癌症。

BL 主要分为地方性（endemic，eBL）、散发性（sporadic，sBL）和免疫缺陷相关型三种临床亚型。其中，eBL 在撒哈拉以南非洲地区儿童中尤为常见，严重威胁着当地儿童的健康。研究发现，EBV 在 BL 的发生发展中起着关键作用，其基因组的变异可能影响肿瘤细胞逃避免疫系统监视和阻碍细胞凋亡的能力，还可能改变肿瘤驱动基因，影响肿瘤的生存。然而，目前关于 EBV 变异与 BL 肿瘤发生之间的确切关系仍不明确。

这主要是因为对 EBV 基因组的研究面临诸多挑战。EBV 基因组相对人类基因组极小，肿瘤细胞中 EBV 拷贝数可能极低，使得对其基因组的检测困难重重。现有的全基因组富集方法不仅昂贵，且需要大量时间和复杂的操作。同时，EBV 基因组富含 GC（59.5%），大多数测序和富集方法存在 GC 含量相关的读取覆盖偏差，导致病毒序列在标准全基因组扩增中容易丢失。此外，Illumina 测序读长有限，难以跨越 EBV 基因组的重复区域，使得对这些区域的分析受到极大限制。并且，Illumina 测序设备及其相关成本较高，对于资源有限的非洲地区实验室来说，难以广泛应用。

为了解开这些谜团，布朗大学（Brown University）的研究人员展开了深入研究。他们旨在开发一种快速、经济高效的方法，用于从肿瘤样本中对 EBV 进行靶向全基因组测序，这一研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。他们利用选择性全基因组扩增（selective whole genome amplification，sWGA）技术，结合新型的 EquiPhi29?聚合酶，在复杂的肿瘤样本背景中特异性地扩增 EBV 基因组。随后，通过两管多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）进一步富集目标区域，并运用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies，ONT）进行长读长测序。在实验过程中，使用了多种细胞系和患者肿瘤样本，包括 9 种标准 BL 细胞系、9 种新建立的肯尼亚儿科 BL 患者来源的细胞系以及 3 名儿科 BL 患者的肿瘤样本。

研究结果令人瞩目。在优化 sWGA 反应时，研究人员发现当输入 DNA 体积为 12.5 ng，dNTP 浓度为 30/30/5/5 mM（G/C/A/T）时，能获得最高比例的 EBV 映射读数。同时，采用 ONT 的去分支协议处理 sWGA 产物，有效提高了测序输出。在此基础上，添加区域特异性多重 PCR 后，测序覆盖度更加均匀，显著提高了 EBV 相对于人类 DNA 的富集度。对于低覆盖度的 EBNA2 和 LMP2 区域，研究人员设计了单引物对（singleplex）PCR 进行扩增，成功增加了这些区域的覆盖度。

对 18 种细胞系和 3 种患者肿瘤样本进行测序和组装后，结果显示 ONT 组装的基因组覆盖了 EBV 基因组的所有关键基因，与 Illumina 组装的基因组相似度高达 99.61%。在重复区域的覆盖上，虽然无法覆盖最长的 IR1（23,355 bps）等部分区域，但大部分小于 1000 bps 的重复区域都能实现连续组装覆盖。

通过系统发育分析发现，ONT 组装的基因组与 Illumina 组装的基因组聚类紧密，且 ONT 组装的基因组分支长度更短，这表明其可能具有更低的错误率。

研究结论和讨论部分表明，该研究开发的新方法显著改进了从肿瘤细胞系和患者肿瘤活检中选择性扩增 EBV 基因组的技术，能够在便携式 ONT 测序仪上进行直接长读长测序，并以经济高效的方式准确组装全基因组。这一方法的出现，为研究 EBV 变异与 BL 的关系提供了有力工具，有助于深入了解 EBV 在肿瘤发生中的作用机制。同时，该方法对于资源有限的实验室，尤其是非洲地区的实验室具有重要意义，为快速评估病毒和表征肿瘤细胞系中的 EBV 奠定了基础，有望推动相关临床应用的发展，如快速测序和鉴定具有预后意义的病毒变异，为患者的诊断和治疗提供更精准的依据 。