整合代谢组学和转录组学揭示三种柴胡属植物根中萜类化合物差异及分子基础：为柴胡资源开发提供新视角

《BMC Plant Biology》：Integrated metabolomics and transcriptomics reveal differences in terpenoids and the molecular basis among the roots of three Bupleurum species

为探究三种柴胡属植物（Bupleurum chinense DC.、Bupleurum scorzonerifolium Willd.、Bupleurum marginatum var. stenophyllum）根中主要化学成分差异的分子机制，研究人员开展整合代谢组和转录组分析。结果发现三种柴胡代谢物和基因表达有差异，该研究为柴胡临床应用和育种提供理论依据。

　　柴胡，作为一种在中医药领域应用历史悠久的多年生草本植物，其身影遍布中国、俄罗斯、蒙古、韩国和日本等地。早在《神农本草经》中，柴胡就已被记载，在中国的药用历史超过 2000 年。如今，柴胡的干燥根被广泛应用于全球的草药医学领域，多种柴胡品种更是被收录进中国、日本、韩国、英国以及欧洲的药典之中。它具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效，对感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调以及子宫脱垂、直肠脱垂等病症有着良好的治疗效果。
柴胡的主要活性成分包括三萜皂苷（saikosaponins，SSs）和挥发油。其中，SSs 具有抗炎、护肝和免疫调节等多种药理活性，而挥发油则具备解热、抗炎的作用。然而，不同种柴胡在化学成分、含量以及药理活性上存在着显著差异。例如，中国药典 2020 版仅将北柴胡（Bupleurum chinense DC.，Bchi）和狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.，Bsco）列为正品柴胡来源，而竹叶柴胡（Bupleurum marginatum var. stenophyllum，Bmar）虽未被药典收录，但因其较高的产量和 SSs 含量，常作为市场替代品，这也使得对其研究日益增多。研究表明，Bsco 的解热效果强于 Bchi，Bchi 的抗炎作用则更胜一筹，Bchi 皂苷的护肝效果优于 Bsco，而 Bmar 与 Bchi 在护肝效果上差异不明显。
尽管已知环境、农艺措施和种质等因素会影响柴胡次生代谢产物中有效成分的积累，但对于三种柴胡在成分上的差异及其具体原因，仍缺乏系统的研究。同时，目前对不同柴胡中不同化合物与特定基因之间相关性的研究较少。因此，深入探究这三种柴胡化学组成差异背后的分子机制，对于提高柴胡中 SSs 的含量和质量，以及指导柴胡的临床应用和定向育种具有重要意义。
中国医学科学院药用植物研究所的研究人员为了解决上述问题，开展了一项整合代谢组学和转录组学的研究，旨在揭示三种柴胡根中代谢物和基因表达的差异，进而探究其分子机制。该研究成果发表在《BMC Plant Biology》杂志上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，种植三种柴胡（Bchi、Bsco 和 Bmar），并在其开花期采集两年生植株的根作为样本（每个样本类型设置三个生物学重复）。然后，利用超高效液相色谱 - 电喷雾电离 - 四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS，LC-MS）和气相色谱 - 串联质谱（GC-MS/MS）技术对样本进行代谢组学分析，以鉴定和定量代谢物。同时，提取样本的总 RNA，构建 cDNA 文库，通过 Illumina NovaSeq 6000 平台进行转录组测序，分析基因表达情况。最后，对代谢组和转录组数据进行整合分析，探究代谢物与基因之间的关系。
代谢谱分析：研究人员运用 LC-MS 和 GC-MS 技术，对九份样本进行了代谢组学的定性和定量分析。结果显示，LC-MS 平台共检测到 1,567 种代谢物，其中萜类化合物有 170 种；GC-MS 平台检测到 183 种代谢物，萜类化合物有 37 种。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）结果表明，三种柴胡的代谢谱存在明显差异。进一步分析发现，Bsco 中挥发油单萜类化合物含量最高，而 Bmar 中三萜皂苷和倍半萜类化合物含量较高。
差异积累代谢物（DAMs）分析：以 FC≥2、VIP≥1 和 p-value<0.05 为筛选标准，研究人员对三种柴胡根中的 DAMs 进行了筛选。结果发现，Bchi 与 Bsco 组有 398 个 DAMs，Bchi 与 Bmar 组有 436 个 DAMs，Bsco 与 Bmar 组有 652 个 DAMs。KEGG 通路分析显示，这些 DAMs 主要富集在萜类化合物生物合成途径，这表明萜类化合物生物合成的差异是导致三种柴胡功能不同的重要原因。
转录组分析：对三种柴胡根的九个样本进行转录组测序，共获得 56.90 Gb 的清洁数据，组装得到 99,974 个单基因（unigenes）。通过筛选，在 Bchi 与 Bmar、Bchi 与 Bsco、Bsco 与 Bmar 中分别鉴定出 7,002 个、29,442 个和 28,239 个差异表达基因（DEGs）。KEGG 富集分析表明，这些 DEGs 主要富集在倍半萜和三萜生物合成、萜类骨架生物合成等相关途径，这与代谢组分析结果一致，进一步证明了萜类合成途径在柴胡主要代谢途径中的重要性。
萜类化合物生物合成途径相关基因表达模式分析：研究人员对 119 个与萜类化合物生物合成途径相关的基因进行分析，发现不同柴胡根中这些基因的表达存在显著差异。例如，β- 香树素合酶（β-AS）基因在 Bmar 中的表达显著高于 Bchi 和 Bsco，这可能导致 Bmar 中 β- 香树素的合成增加，进而使 SSs 的相对含量升高。此外，3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 合酶（HMGS）、3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）等基因在 Bmar 中也有较高表达，而单萜合酶（MPS）基因在 Bsco 中高表达。
萜类化合物含量与萜类化合物生物合成基因表达的相关性分析：通过 Pearson 相关性分析，研究人员发现 Bchi、Bsco 和 Bmar 中，参与 saikosaponin 合成途径的 DEGs 与 6''- 乙酰基 - saikosaponin A（6''-acetyl-SSa）、saikosaponin B1（SSb1）、saikosaponin C（SSc）和 saikosaponin D（SSd）的相对含量存在显著相关性。同时，还发现两个细胞色素 P450（CYP450）基因（Bc087391 和 Bc036879）与三种 saikosaponin 化合物（6''-acetyl-SSa、SSb1 和 SSd）密切相关，这两个基因可能参与了 saikosaponin 的生物合成。
亚细胞定位：研究预测 CYP450 基因（Bc087391 和 Bc036879）定位于内质网，通过构建融合表达载体并转化至烟草叶片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察发现，融合蛋白 Bc087391-eGFP 和 Bc036879-eGFP 的荧光信号主要集中在内质网，证实了这一预测。
研究通过整合代谢组学和转录组学分析，揭示了三种柴胡根中萜类化合物生物合成途径的差异。研究发现，Bmar 中较高的 SSs 含量可能与 β-AS 基因的高表达有关，而 Bsco 中较高的单萜含量可能与 MPS 基因的高表达有关。此外，研究还鉴定出了与 saikosaponin 合成相关的关键基因，为深入理解不同柴胡中活性成分形成的分子机制提供了理论依据。这一研究成果对于柴胡资源的临床应用、定向育种以及萜类化合物生物合成机制的研究具有重要意义，为后续相关研究奠定了坚实基础，有望推动柴胡属植物在医药领域的进一步开发和利用。**<