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为探究 2 型常染色体显性骨硬化症（ADO2）的病理机制，桂林医学院研究人员利用基因编辑技术构建 ADO2 小鼠模型，借助 SUGAR-seq 技术分析骨髓细胞。结果发现 CLCN7(R286W)是致病突变，单核细胞存在异质性。该研究为理解 ADO2 发病机制提供依据。
骨硬化症是一种罕见的遗传性骨病，发病率约为 1:100,000 - 1:50,000，以骨骼代谢异常导致的弥漫性骨骼硬化为特征。目前临床上分为成人良性常染色体显性骨硬化症、中间型常染色体隐性骨硬化症和婴儿恶性常染色体隐性骨硬化症，其中最常见的是 2 型常染色体显性骨硬化症（ADO2），与 CLCN7 基因突变相关。然而，目前对于 ADO2 的治疗手段有限，仅能进行对症治疗来延缓疾病进展。此前研究虽发现 CLCN7
(R286W)可能是 ADO2 常见突变，但缺乏动物模型验证，且骨髓细胞在单细胞水平的特征也完全未知。此外，单核吞噬细胞在骨代谢中起关键作用，其表面的 N - 糖基化修饰参与多种生理过程，对骨代谢也至关重要，但在 ADO2 中的变化情况尚不明确。在这样的背景下，为了深入探究 ADO2 的发病机制，桂林医学院的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《BMC Biology》上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，利用 CRISPR/Cas9 技术构建携带 Clcn7(r284w)突变的 ADO2 小鼠模型，该突变对应人类患者中的 CLCN7(R286W)突变；其次，采用表面蛋白聚糖和 RNA 测序（SUGAR-seq）技术，对小鼠骨髓细胞的 RNA 表达和 N - 糖基化谱进行单细胞分析；此外，还运用了流式细胞术、LC-MS/MS-based 4D label-free proteomics 等技术对相关结果进行验证和进一步分析。
研究结果如下：
- ADO2 小鼠模型的建立与特征分析：通过基因编辑技术成功构建了 ADO2 小鼠模型，经测序确认存在 Clcn7(R284W)突变。X 射线检查显示，ADO2 小鼠骨髓腔体积减小，骨密度增加；HE 染色表明，其皮质骨增厚，小梁骨变厚；PET/CT 成像显示，ADO2 小鼠的骨代谢明显慢于野生型（WT）小鼠，这些结果证实了模型的成功建立。
- ADO2 小鼠骨髓细胞（BMCs）的异质性分析：利用 SUGAR-seq 技术，研究人员成功鉴定出 14 种不同的细胞亚群。与 WT 小鼠相比，ADO2 小鼠的骨髓细胞中，粒细胞 - 单核细胞祖细胞（GMP）、中性粒细胞、单核细胞、T 和 NK 细胞（TandNK）、成熟 B 细胞（MatureB）、红细胞祖细胞（ProEryth）、常规树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）的比例存在显著差异。同时，SUGAR-seq 分析发现，ADO2 小鼠骨髓细胞表面的 N - 糖基化修饰水平显著下调，这一结果在不同细胞亚群中均有体现。
- ADO2 中单核吞噬细胞的异质性分析：单核吞噬细胞系统在骨骼健康中起着重要作用，研究人员进一步聚焦于单核细胞与破骨细胞的关系。通过对单核细胞进行分类，发现经典单核细胞（ClassicalMono）和非经典单核细胞（NonClassicalMono），且经典单核细胞占比较高。进一步对经典单核细胞进行亚型分析，发现 ADO2 小鼠中 CM2 和 CM4 亚型的比例与 WT 小鼠存在显著差异。对差异表达基因（DEGs）的分析表明，CM2 和 CM4 中下调的 DEGs 与破骨细胞分化相关。
- ADO2 中单核吞噬细胞 N - 糖基化的分析：SUGAR-seq 分析显示，ADO2 小鼠单核吞噬细胞各亚型的表面 N - 糖基化水平显著降低，尤其是经典单核细胞的六个亚型。通过 Monocle 伪时间分析和 CytoTRACE 分析，发现不同亚型的分化轨迹和分化潜能存在差异，且 ADO2 小鼠各分支的 N - 聚糖值显著低于 WT 小鼠。此外，LC-MS/MS 分析证实，ADO2 小鼠中许多蛋白质的 N - 糖基化存在差异，整合素家族蛋白的 N - 糖基化修饰位点丰度普遍降低。
- 基于 LC-MS/MS 的 4D 无标记蛋白质组学分析：该分析发现，ADO2 小鼠骨髓细胞中整合素相关蛋白 Itgb7 的表达异常升高，与单细胞测序结果一致。
研究结论和讨论部分表明，本研究首次建立了携带 Clcn7(R284W)突变的 ADO2 小鼠模型，证实了人类 CLCN7(R286W)是 ADO2 的致病突变。同时，单细胞分析揭示了 ADO2 中单核细胞的异质性，以及不同亚型中异常的糖基化修饰，这些修饰可能在骨硬化症的发病机制中发挥重要作用。此外，研究还发现骨髓细胞的代谢重编程可能是 ADO2 的重要病理特征，整合素表达和 N - 糖基化的改变可能影响破骨细胞的分化和功能。不过，SUGAR-seq 技术存在一定局限性，未直接分析糖基转移酶的动态变化和 N - 聚糖的结构变异。未来研究需整合更多方法，深入探究这些因素在疾病过程中的作用，为 ADO2 及相关疾病的研究提供更全面的视角和理论依据，推动相关治疗策略的开发和药物发现。
