综述：缺血性脑卒中（IS）中细胞外囊泡来源的微小 RNA（miRNAs）：在神经保护、组织再生中的作用及作为生物标志物的潜力

《Cellular and Molecular Neurobiology》：Extracellular Vesicle-Derived miRNAs in Ischemic Stroke: Roles in Neuroprotection, Tissue Regeneration, and Biomarker Potential

这篇综述聚焦缺血性脑卒中（IS），探讨细胞外囊泡（EVs）来源的微小 RNA（miRNAs）在其中的作用。研究发现，这些 miRNAs 参与 IS 病理过程，在神经保护、组织再生方面意义重大，还可能作为诊断和预后的生物标志物，极具研究价值。

　　### 缺血性脑卒中中细胞外囊泡来源的微小 RNA 研究进展
缺血性脑卒中（Ischemic Stroke，IS）是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。尽管其发病率高，但目前对其病理生理学机制和诊断方法的了解仍较为有限。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是从细胞膜分泌的脂质双分子层包裹的颗粒，可携带多种细胞内物质，其中微小 RNA（microRNAs，miRNAs/miR）作为 mRNA 转录调节因子，在细胞间通讯中发挥重要作用，与 IS 的发生发展密切相关。本文将围绕 EVs 来源的 miRNAs 在 IS 中的作用展开综述。

1. 体外和动物研究

1.1 微胶质细胞激活与神经组织来源的外泌体在缺血后神经保护和恢复中的作用

微胶质细胞是中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的常驻巨噬细胞，在 CNS 发育、内环境稳定和神经发生中至关重要。在 IS 后，微胶质细胞的激活和极化对神经元损伤和修复起着关键作用，但其过度激活也可能加重脑组织损伤。

研究发现，受损但仍存活的神经元释放的 EVs 中含有 miR-98，可靶向 PAFR，抑制微胶质细胞对凋亡细胞的吞噬作用，保护受损神经元。在大鼠 IS 模型中，miR-98 在缺血半暗带的表达在最初 24 小时内保持稳定，3 天后显著下降。

神经组织分泌的外泌体对 IS 的发病机制和缺血后修复也十分重要。神经祖细胞（Neural Progenitor Cells，NPC）来源的 EVs 在体外可抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的微胶质细胞产生促炎细胞因子，在小鼠大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型中能减轻炎症反应。对 NPC 来源的 EVs 中 miRNA 含量的测序分析表明，miR-99a-5p、miR-139-5p 等多种 miRNAs 参与抑制 MAPK 等炎症通路。

此外，神经干细胞（Neural Stem Cells，NSC）来源的外泌体中富含 miR-150-3p，可靶向 CASP2 mRNA，影响神经元增殖。在体外氧糖剥夺 / 复氧（Oxygen–Glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R）处理的 SH-SY5Y 细胞和 MCAO 大鼠模型中，NSC 来源的外泌体均表现出神经保护作用，而抑制 miR-150-3p 则会削弱这种作用，表明 miR-150-3p 在缺血后组织再生中具有重要作用。

1.2 星形胶质细胞来源的外泌体 miRNAs 在缺血中的作用

多项研究表明，星形胶质细胞来源的外泌体在脑缺血后的神经保护中发挥重要作用。通过对星形胶质细胞来源的外泌体进行 RNA 测序发现，miR-378a-5p 在调节神经炎症中起关键作用，它可直接结合 NLRP3 mRNA 的 3’非翻译区（3’UTR）。在大鼠 MCAO 模型和原代神经元 OGD 模型中，过表达 miR-378a-5p 可减轻神经元损伤，抑制神经元焦亡，发挥神经保护作用。

研究还发现，星形胶质细胞来源的外泌体可通过递送 miR-138-5p 促进神经元线粒体自噬，减轻缺血损伤。在 MCAO 大鼠模型中，静脉注射携带 miR-138-5p 的工程化微胶质细胞载体与脑室内注射具有相似的治疗效果，显示出细胞载体靶向递送系统在 IS 治疗中的潜力。

此外，miR-190b 在星形胶质细胞来源的外泌体中显著上调，其可通过调节自噬抑制 OGD 诱导的神经元凋亡。这些研究表明，靶向特定的星形胶质细胞来源的外泌体 miRNAs，如 miR-378a-5p、miR-138-5p 和 miR-190b，可能为 IS 提供新的治疗策略。

1.3 骨髓和干细胞来源的 EV 相关 miRNAs 对缺血后神经损伤的影响

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）治疗在改善 IS 后神经功能缺损和生活质量方面展现出潜力。研究发现，人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells，HUCMSC）来源的外泌体可减少小鼠 IS 模型中缺血半暗带的体积，减轻行为障碍，降低促炎细胞因子 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 的表达。在体外，HUCMSC 来源的外泌体可改变微胶质细胞的激活模式，减少促炎的 M1 型细胞，增加抗炎的 M2 型细胞。进一步研究表明，外泌体中的 miR-146a-5p 通过抑制 IRAK1/TRAF6 信号通路，在缺血 / 再灌注神经炎症中发挥重要作用。

近期研究发现，缺氧处理的 MSCs 及其来源的外泌体（HypoExo）在缺血中具有更好的神经保护作用。miRNA 微阵列分析显示，HypoExo 富含 miR-214-3p，其可通过直接抑制 PTEN/Akt 通路，抑制磷脂酰肌醇信号通路，敲低 miR-214-3p 会消除 HypoExo 的有益作用，表明缺氧处理的 MSCs 通过 miR-214-3p/PTEN 轴增强缺血后的神经保护。

骨髓来源的干细胞（Bone Marrow-Derived Stem Cells，BMSCs）来源的 EVs 在心肌缺血 / 再灌注损伤中具有保护作用，在 IS 患者中也表现出差异表达，可能是一种神经保护因子。BMSCs 来源的外泌体中，miR-221-3p 可靶向激活转录因子 3（Activation Transcription Factor 3，ATF3），调节缺血应激损伤后炎症过程的进展；miR-21-5p 可促进缺血损伤组织中的血管生成，减少 MCAO 小鼠的梗死体积，降低神经功能缺损评分。体外实验表明，BMSCs 可将 miR-21-5p 转移到内皮细胞中，增强细胞增殖、迁移和管形成能力，抑制 miR-21-5p 会抑制这种促血管生成活性，提示外泌体来源的 miR-21-5p 可作为潜在的治疗 IS 的药物。

此外，研究还发现，IS 可诱导骨髓微环境改变，增加 EVs 中 miR-141-3p 和 miR-34a 的表达。脂肪来源的干细胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs）来源的外泌体在 IS 治疗中也有一定作用。转染 miR-126 的 ADSCs 来源的外泌体可改善 MCAO 大鼠的功能恢复，促进血管生成和神经发生；miR-31 可通过抑制 TRAF6 和 IRF5 的表达，减少凋亡相关因子 caspase-3 和 Bax 的产生，改善小鼠的神经功能，减少梗死体积和神经元凋亡；miR-22-3p 可通过靶向 KDM6B 抑制凋亡通路，减轻缺血后神经元损伤。

1.4 远程缺血后处理通过 EV 相关 miRNAs 对神经保护的影响

远程缺血后处理（Remote Ischemic Post-Conditioning，RIPC）是一种可改善急性 IS 患者临床结局的辅助治疗方法。研究发现，RIPC 可增加血浆中外泌体来源的 miR-126 水平，在体外培养的人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 中，RIPC 外泌体可降低 DNA 甲基转移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）3B 的表达和活性，延长细胞周期的 S 期，发挥神经保护作用。

此外，miR-199a-5p 也参与了 RIPC 诱导的缺血耐受过程。缺氧 / 复氧（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）条件下，人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）及其来源的外泌体中 miR-199a-5p 表达增加，给予 HUVEC 来源的外泌体可抑制神经细胞的炎症和凋亡，敲低 miR-199a-5p 会削弱这种保护作用。

尿液来源的干细胞（Urine-Derived Stem Cells，USC）来源的外泌体在 IS 治疗中也具有一定潜力。静脉注射 USC 来源的外泌体可减少大鼠 MCAO 后的梗死体积，改善功能恢复，促进神经干细胞的增殖和分化，其作用机制与 miR-26a 水平增加有关，miR-26a 可通过抑制组蛋白去乙酰化酶 6 促进神经干细胞的增殖和分化。

研究还发现，远程肢体缺血后处理（Remote Limb Ischemic Postconditioning，RLIP）大鼠血浆来源的外泌体中，miR702-3p 和 miR-423-5p 显著上调，它们可调节 NOD1 和 NLRP3 基因，减轻脑缺血 - 再灌注损伤，改善神经功能。

2. 人体研究

2.1 外泌体

外泌体存在于外周血中，可作为临床诊断的有价值材料。研究发现，IS 会影响多种外泌体来源的 miRNAs 的表达，这些 miRNAs 在动物和体外研究中的作用也在人体研究中得到证实。

miR223 是健康个体血浆中常见的外泌体来源的 miRNA，在 IS 患者的急性期，其表达显著上调，且与美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分和 3 个月后的神经功能结局呈正相关，但与梗死体积无关。

miR-126 在缺血损伤后的神经保护中起重要作用，在 IS 患者急性期，其血浆水平显著降低，且与 Barthel 指数呈正相关，表明较高的 miR-126 水平与更好的临床状况和日常生活活动能力相关。

miR-152-3p 在 IS 患者中表达下调，且与临床观察到的卒中严重程度相关，在大动脉粥样硬化患者中其表达最低。miR-134 在 IS 患者发病 24 小时内表达增加，与 NIHSS 评分、梗死体积和不良预后相关，且与炎症标志物 C 反应蛋白（C-Reactive Protein，CRP）和 IL-6 水平相关，提示其可能参与 IS 后的炎症反应和神经元损伤。

此外，研究还发现，miR-21-5p 和 miR-30a-5p 在 IS 的不同阶段表达不同，联合检测这两种 miRNAs 可能有助于 IS 的早期诊断和分期。miR-30d-5p 在 IS 患者中表达下调，其可调节炎症反应，可能参与 IS 后的炎症调节过程。miR-125b-2-3p 和 miR-422a 在 IS 患者的亚急性期表达显著降低，其中 miR-422a 在急性期表达升高，可能作为急性 IS 的潜在生物标志物。

2.2 微囊泡和其他类型的 EVs

微囊泡是由多种细胞释放的囊泡结构，内皮微囊泡（Endothelial Microvesicles，EMVs）及其携带的 miR-155 在 IS 患者的急性和亚急性期表达升高，且与 NIHSS 评分、梗死体积和 IS 类型相关，在大动脉粥样硬化和心源性栓塞患者中表达更高。miR-155 在氧化应激、凋亡和炎症中起重要作用，抑制 miR-155 可减少凋亡和活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）产生，促进一氧化氮（Nitric Oxide，NO）生成，因此，EMVs 和 EMV-miR-155 可能作为识别 IS 患者的敏感生物标志物。

研究表明，EV 相关的 miRNAs 在区分缺血性和出血性卒中类型方面具有潜在的诊断价值。通过对 IS 患者血浆 EVs 样本的微阵列分析，发现了多种差异表达的 miRNAs，如 let-7b-5p、miR-16-5p 等，这些 miRNAs 可能参与了 IS 的病理过程，可作为潜在的诊断生物标志物。

最近对急性 IS 患者中神经元来源的细胞外囊泡（L1CAM 阳性 EVs-L1EVs）的研究发现，其中的小 RNA 谱发生了显著改变，通过机器学习建立的随机森林模型可利用特定的 8 个小 RNA 特征区分急性 IS 患者，显示出 L1EVs 作为卒中诊断生物标志物的潜力。

3. IS 中 EVs 和外泌体 miRNAs 的局限性和挑战

3.1 miRNA 研究的标准化和可重复性

目前，EVs 和外泌体 miRNAs 研究面临的最大挑战之一是方法学缺乏标准化，包括 EVs 和外泌体的分离、定量方法，以及 miRNA 定量的归一化策略。不同的分离技术，如超速离心、尺寸排阻色谱、流式细胞术和沉淀法等，会导致实验室结果不可重复，缺乏统一的标准化方法使得不同研究之间难以进行比较。

3.2 miRNAs 作为生物标志物的特异性 / 敏感性

虽然循环 miRNAs 作为 IS 潜在生物标志物具有一定前景，但其特异性和敏感性仍存在问题。许多与卒中病理相关的 miRNAs 也与其他神经退行性和心血管疾病相关，这给区分卒中与其他疾病带来了困难。此外，虽然一些 miRNAs 在缺血事件后表达发生改变，但它们在卒中不同阶段的动态变化尚未得到充分研究，限制了基于 miRNA 的诊断和治疗的临床应用。

3.3 缺乏大规模临床验证

目前关于 IS 中 EVs 和外泌体 miRNAs 的研究大多基于小样本量或动物模型 / 体外分析，虽然这些初步研究结果有一定价值，但仍需要大规模、多中心的临床试验来验证 miRNAs 在卒中患者中的诊断和预后潜力。此外，IS 亚型的异质性要求进行广泛的患者队列研究，以建立特定于卒中的 miRNA 谱。

3.4 实施的成本和可行性

目前，基于 miRNA 的诊断和治疗在临床应用中成本较高，从 EVs 和外泌体中分离小 RNA 并进行测序的过程昂贵，且需要医院具备专业的实验室基础设施。开发经济高效、快速且可扩展的 miRNA 检测方法对于临床应用至关重要。随着下一代和单细胞 RNA 测序成本的不断降低，小 RNA 分析在卒中治疗中的应用有望更加普遍，可能改善临床卒中管理。

4. 结论

miRNAs 在多种组织中大量表达，可通过 EVs 释放并被其他细胞摄取，远程调节基因表达。目前的研究表明，多种 EV 相关的 miRNAs 参与了 IS 发病机制的几乎所有方面，包括内皮功能、凝血、炎症反应、微胶质细胞活性、细胞凋亡和增殖等，因此可作为潜在的诊断、预后生物标志物和治疗靶点进行广泛研究。

虽然目前关于 IS 中 EV 相关 miRNAs 的数据有限，但它们可能是有用的预后指标。一些人体研究表明，某些类型的 miRNAs 可能是潜在的临床生物标志物，但需要在更大的患者队列中进行进一步研究。此外，由于缺血性病变发展的动态性和 IS 治疗的特异性，未来的研究应不仅关注卒中发病后最初几天和几周内 miRNA 表达的变化，还应关注发病后最初几小时内的变化。然而，由于症状发作时间往往难以确定，许多患者在发病数小时后才入院，这给研究带来了挑战。

尽管 EVs 和外泌体 miRNAs 在 IS 中具有潜在的应用前景，但在临床应用之前，还需要解决上述提到的一些局限性和挑战，如改进实验室方法的标准化、确定特异性和敏感性更高的生物标志物、开展大规模临床试验以及克服递送难题等，以推动基于 miRNA 的创新在卒中诊断、预后和治疗中的应用。