一种用于结节性皮肤病病毒体外中和及诊断检测的双功能单克隆抗体：开辟牛病防控新路径

《Animals and Zoonoses》：A dual-purpose monoclonal antibody for in vitro neutralization and diagnostic detection of the lumpy skin disease virus

为解决结节性皮肤病病毒（LSDV）对全球养牛业造成重大经济损失、缺乏有效防治策略的问题，研究人员开展针对 LSDV ORF117 蛋白关键表位的双功能单克隆抗体（mAb 9E3）研究。结果显示 mAb 9E3 可用于检测 LSDV 抗体且能体外中和病毒，为防治 LSDV 提供新途径。

　　结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD）是一种严重威胁全球牛和水牛种群的高度传染性跨界病毒性疾病。它以独特的结节性皮肤病变为特征，不仅影响动物健康，导致牛奶产量下降、肉质降低和死亡率上升，还严重扰乱了农业生产力和国际贸易。自 1929 年在南非首次发现以来，LSDV 已在北非、中东和亚洲广泛传播，给当地的畜牧业带来了沉重打击。

目前，虽然世界动物卫生组织（WOAH）已将其列为须通报疾病，但 LSDV 蛋白的功能和致病机制仍不明确，这给针对性疫苗和治疗方法的开发带来了巨大挑战。在痘苗病毒研究中，一些病毒蛋白已成为疫苗开发和治疗干预的有前景的靶点，比如痘苗病毒（VACV）的 A27L 蛋白。而 LSDV 的 ORF117 蛋白与 A27L 蛋白有显著同源性，且抗原性指数高，具有作为诊断和治疗靶点的潜力，但人们对其抗原表位、作用机制以及针对它的单克隆抗体（mAbs）的临床应用了解有限。

为了填补这些空白，寻求有效的 LSDV 防治策略，南京农业大学的研究人员开展了相关研究。他们成功开发了一种双功能单克隆抗体 mAb 9E3，该抗体针对 LSDV ORF117 蛋白的关键表位，既可以作为敏感且特异的诊断工具，又能在体外抑制病毒感染和细胞间病毒传播。这一成果发表在《Animals and Zoonoses》上，为全球牛健康保护提供了新的思路和方法。

研究人员在这项研究中用到了多种关键技术方法。在蛋白相关实验方面，利用原核表达系统表达并纯化 LSDV ORF117 重组蛋白；通过小鼠免疫、细胞融合和筛选获得分泌 mAb 9E3 的杂交瘤细胞系。在检测分析方面，运用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质免疫印迹（western blotting）、间接免疫荧光试验（IFA）等技术对 mAb 9E3 的免疫原性、特异性等进行鉴定；建立并优化基于 mAb 9E3 的阻断酶联免疫吸附试验（bELISA）用于 LSDV 血清学诊断；还通过 qRT-PCR、TCID₅₀等实验评估 mAb 9E3 对 LSDV 的中和效果。实验样本队列来源包括多种病毒株、血清样本、细胞和实验动物等。

下面来具体看看研究结果：

• 重组蛋白表达与纯化：将优化后的 447bp 的 LSDV ORF117基因片段插入 pCold I 载体，构建重组质粒 pCold I - ORF117，经 PCR、酶切和测序验证成功。该重组质粒在大肠杆菌中主要以不溶性形式表达，经 HisCap 6FF 柱和 AKTA 蛋白纯化系统纯化，SDS - PAGE 和 western blotting 验证得到 22.6kDa 的目标蛋白。
• mAb 9E3 的制备与鉴定：通过小鼠脾淋巴细胞与 SP2/0 细胞融合，筛选出 8 个杂交瘤克隆，其中 9E3 细胞系能特异性结合 LSDV ORF117 蛋白。纯化后的 mAb 9E3 经鉴定为 IgG1/κ 亚型，抗体效价为 1:64000。western blotting 和 IFA 实验表明 mAb 9E3 与 LSDV ORF117 重组蛋白和 LSDV 均能特异性反应，且对其他常见牛病原体无交叉反应，特异性良好。
• bELISA 的建立与优化：以 LSDV ORF117 蛋白为包被抗原，mAb 9E3 为检测抗体，建立 bELISA。通过棋盘滴定等优化，确定了最佳抗原包被浓度、血清稀释比、各抗体孵育时间和显色时间等参数。
• bELISA 的性能评估：对 70 份 LSDV 阴性血清样本分析，确定 bELISA 的临界值，PI≥7.68% 为阳性，PI<5.10% 为阴性，5.10% - 7.68% 为可疑。该方法对其他常见牛病阳性血清检测均为阴性，特异性良好；批内和批间变异系数（CV）<15%，重复性和再现性优秀；对 LSDV 阳性血清的最高阳性稀释度可达 1:4 - 1:16，分析灵敏度强。
• mAb 9E3 的体外中和作用：在 MDBK 细胞中，mAb 9E3 处理的感染细胞病变效应（CPE）明显减轻，病毒滴度显著降低，P32 蛋白表达水平和ORF043/ORF077转录水平下降，表明 mAb 9E3 能有效中和 LSDV 感染。
• mAb 9E3 对病毒传播的抑制作用：在体外实验中，mAb 9E3 能有效抑制 LSDV 在细胞间的传播，相比对照组，感染细胞的荧光标记减少，感染细胞比例显著降低。
• 抗原表位的鉴定：通过构建 LSDV ORF117 基因片段转染 293T 细胞，经 IFA 确定 mAb 9E3 识别的关键抗原表位为 110CNSLKNII117。
• 抗原表位的结构与特性分析：预测 mAb 9E3 识别的抗原表位包含多个 α - 螺旋结构，在 LSDV ORF117 蛋白三维结构表面暴露，呈弯曲线性结构。该表位在痘苗病毒属中高度保守，与其他痘苗病毒属的同源性较低。

综合研究结论和讨论部分，此次研究意义重大。研究人员成功开发了双功能单克隆抗体 mAb 9E3，它在 LSDV 的诊断和治疗方面展现出巨大潜力。在诊断上，基于 mAb 9E3 的 bELISA 具有高灵敏度、特异性和可重复性，为 LSDV 的血清学检测提供了新的有效手段。在治疗方面，mAb 9E3 能在体外中和 LSDV 并抑制其细胞间传播，虽然目前缺乏体内保护试验，但基于类似研究的推测，它有可能在体内发挥中和活性。此外，研究还鉴定出 mAb 9E3 识别的保守抗原表位 110CNSLKNII117，为开发基于表位的疫苗和诊断工具提供了新靶点，加深了人们对 LSDV ORF117 在病毒感染和致病机制中作用的理解，为全球牛健康保护和 LSDV 防控策略的制定提供了重要依据，也为后续开发更有效的疫苗和治疗方法奠定了坚实基础。