基于热迁移分析技术(TSA)的SARS-CoV-2 Nsp13解旋酶抑制剂高通量筛选策略研究

编辑推荐：为解决COVID-19抗病毒药物靶点单一问题，研究人员采用热迁移分析(TSA)技术对1970种FDA批准药物进行高通量筛选，发现26种与Nsp13解旋酶高亲和力结合的化合物，其中7种(如苯尼地平IC50=1.07μM)抑制ATP酶活性，4种(如姜黄素IC50=12.23μM)抑制RNA解旋活性，为开发新型广谱抗冠状病毒药物提供了新策略。

　　新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情虽已不再是全球卫生紧急事件，但SARS-CoV-2变异株仍在流行。目前美国FDA仅批准了三种部分有效的抗病毒药物（瑞德西韦、Paxlovid和莫努匹韦），且均靶向病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Nsp12)或3CL蛋白酶(Nsp5)。面对抗病毒药物靶点单一、开发周期长的困境，寻找作用于病毒复制必需且保守的非结构蛋白Nsp13的解旋酶抑制剂，成为突破当前治疗瓶颈的重要方向。

吉林省教育厅科技研究项目支持的研究团队创新性地采用热迁移分析(Thermal Shift Assay, TSA)技术，建立了一套高效、低成本的药物筛选平台。该技术通过检测化合物与靶蛋白结合后引起的熔解温度(ΔT_m)变化，实现了对1970种FDA批准药物的快速初筛，避免了传统酶活性检测的高成本局限。

研究采用重组His-Nsp13蛋白，通过优化HEPES缓冲体系使TSA检测的信噪比显著提升（T_m从39.6°C升至41.0°C），验证实验显示该方法具有优异的重复性（Z'因子0.96-0.99）。初筛获得26个ΔT_m>3°C的阳性化合物后，研究人员进一步通过ATP酶活性检测（孔雀绿显色法）和FRET-based RNA解旋实验进行功能验证。

在"2. Materials and methods"部分，研究主要运用了以下关键技术：1) 原核表达系统制备His标签重组Nsp13蛋白；2) 基于SYPRO Orange染料的TSA高通量筛选；3) 孔雀绿显色法检测ATP酶活性；4) 荧光共振能量转移(FRET)技术监测dsRNA解旋；5) 分子对接预测结合位点；6) 透析实验评估抑制剂可逆性。

"3. Results"部分揭示的重要发现包括：

• 通过TSA筛选发现26个结合阳性化合物（命中率1.32%），其中7个显示ATP酶抑制活性（苯尼地平IC₅₀=1.07μM，甲基水杨酸IC₅₀=4.53μM等），4个显示RNA解旋抑制活性（依法普仑IC₅₀=12.47μM，蟛蜞菊内酯IC₅₀=14.91μM等）
• MST检测验证结合亲和力，ATP酶抑制剂奥沙拉嗪K_d=0.230μM，解旋酶抑制剂姜黄素K_d=0.430μM
• 分子对接显示ATP酶抑制剂主要结合1A/2A结构域，而解旋酶抑制剂偏好结合stalk/1B结构域
• 透析实验证实所有抑制剂均为可逆结合

"4. Discussion"部分强调，Nsp13在β冠状病毒中高度保守且人类缺乏同源蛋白，是理想的广谱抗病毒靶点。该研究首次建立TSA-based筛选平台克服了传统酶活性检测的局限性，发现的抑制剂具有全新作用机制——尤其值得注意的是，4种RNA解旋酶抑制剂均未报道过抗冠状病毒活性，为后续开发提供了全新化学骨架。虽然部分化合物（如姜黄素）存在化学不稳定性等问题，但该筛选策略可快速扩展至更大化合物库，并为其他病毒蛋白靶点的药物发现提供技术范式。

这项发表于《Animals and Zoonoses》的研究，不仅为COVID-19治疗提供了潜在新靶点，<，我将继续。如果您有任何问题或需要进一步的帮助，请随时告诉我！

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