AMPKα：缓解亚临床酮症奶牛 NEFA 对卵泡颗粒细胞损伤的新希望

《Animal Reproduction Science》：AMPKα alleviates the inhibitory effect of NEFA on the function of bovine follicular granulosa cells cultured in vitro

为探究非酯化脂肪酸（NEFA）影响奶牛卵泡颗粒细胞（GCs）功能的机制，研究人员开展了体内外实验。结果显示，NEFA 抑制 GCs 增殖、诱导凋亡等，而激活 AMPKα 可缓解这些不良影响。该研究为改善奶牛繁殖效率提供了理论依据。

　　在奶牛养殖领域，亚临床酮症（SCK）如同一个隐藏的 “杀手”，给养殖户带来了巨大的经济损失。SCK 是一种在产后奶牛中高发的代谢紊乱疾病，常常伴随着脂肪的过度动员，导致奶牛体内非酯化脂肪酸（NEFA）水平大幅升高。这不仅会增加奶牛患各种疾病的风险，如真胃移位、子宫感染等，还会严重影响奶牛的繁殖效率，导致产后发情异常，许多奶牛甚至出现长时间不发情的情况，使得奶牛的繁殖周期延长，养殖成本大幅增加。

目前，虽然人们知道 NEFA 水平升高与奶牛繁殖问题密切相关，但对于 NEFA 究竟如何影响奶牛卵泡颗粒细胞（GCs）的功能，其中的具体机制却并不清楚。为了解开这个谜团，来自国内的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Animal Reproduction Science》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，对奶牛进行分组实验，通过监测 β - 羟基丁酸（BHBA）水平将奶牛分为 SCK 组和对照组，并进一步筛选出特定的实验对象，如 SCK - AE 组和 C - E 组（SCK - AE 组为 SCK 组中未发情且具有特定卵泡特征的奶牛，C - E 组为健康发情奶牛）。其次，进行样本采集，包括血液、肝脏和卵巢组织等。然后，利用多种实验技术检测相关指标，如通过定量实时逆转录 PCR（qRT - PCR）检测基因表达水平，采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）分析蛋白质表达情况，运用免疫细胞荧光技术检测细胞表面标志物，借助油红染色和免疫组化观察组织形态和蛋白定位，使用流式细胞术测定细胞内活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位、细胞凋亡和细胞周期等。

研究结果如下：

• 血清 NEFA 浓度和卵泡发育率分析：SCK - AE 组奶牛血清和卵泡液中的 NEFA 水平显著高于 C - E 组，且 SCK - AE 组奶牛卵泡发育率明显降低。同时，SCK - AE 组奶牛肝脏和卵巢组织的结构和功能发生改变，如肝脏出现脂肪变性，卵巢组织中脂质滴积累增加，且这些组织中 AMPKα 的磷酸化水平显著升高。
• GCs 的鉴定和活力检测：研究发现，用 0.4 mM NEFA 处理 GCs 24 小时，细胞活力会降低 50%。通过检测 FSHR 蛋白，证实了分离的细胞为 GCs，可用于后续实验。
• NEFA 对 GCs 类固醇激素合成的影响：与未处理的对照组相比，NEFA 处理组中参与类固醇激素合成的关键基因 CYP27B1、CYP19A1、StAR 和 HSD3B1 的 mRNA 和蛋白质水平均显著降低，表明 NEFA 抑制了 GCs 的类固醇激素合成功能。
• NEFA 对 GCs 氧化应激、凋亡和增殖的影响：NEFA 处理使 GCs 内 ROS 生成显著增加，线粒体膜电位显著降低，细胞凋亡率显著升高。细胞周期方面，处于 G1 期的细胞数量显著增加，而 S 期和 G2 期细胞数量显著减少，同时与细胞增殖相关的基因 CCNA1、CCND1、CCNE2 和 CDK1 的 mRNA 和蛋白质水平也显著下降，说明 NEFA 抑制了 GCs 的增殖。
• NEFA 处理后 GCs 中 AMPKα 活性和磷酸化的变化：与对照组相比，NEFA 组中 p - AMPKα 水平和 AMPKα 活性均显著增加，表明 NEFA 激活了 GCs 中的 AMPKα。
• 沉默 AMPKα 对 NEFA 影响 GCs 类固醇激素合成的作用：在 NEFA 处理条件下，沉默 AMPKα（NEFA - siRNA 组）进一步降低了 CYP27B1、CYP19A1、StAR 和 HSD3B1 的 mRNA 和蛋白质表达水平，说明沉默 AMPKα 会加剧 NEFA 对 GCs 类固醇激素合成的抑制作用。
• 沉默 AMPKα 对高 NEFA 环境下 GCs 中 ACC 和 CPT - 1 水平的影响：在高 NEFA 环境下，与正常对照组（Normal - NC）相比，NEFA - NC 组中 ACC 的 mRNA 和蛋白质水平显著降低，CPT - 1 的 mRNA 和蛋白质水平显著升高；而 NEFA - siRNA 组与 NEFA - NC 组相比，ACC 的 mRNA 和蛋白质水平显著升高，CPT - 1 的 mRNA 和蛋白质水平显著降低。
• 沉默 AMPKα 对高 NEFA 环境下 GCs 线粒体损伤、凋亡和增殖的影响：NEFA - NC 组中 GCs 的 ROS 产量、凋亡率显著增加，线粒体膜电位显著降低，细胞周期中 G1 期比例显著增加，S 期和 G2 期比例显著降低。沉默 AMPKα（NEFA - siRNA 组）后，这些变化更为显著，同时相关基因的表达也发生相应改变，表明沉默 AMPKα 增强了高 NEFA 对 GCs 线粒体损伤、凋亡和增殖的影响。

研究结论和讨论部分指出，SCK 导致奶牛体内 NEFA 水平升高，进而抑制体外培养的 GCs 增殖和类固醇激素合成，通过氧化应激和线粒体功能障碍诱导 GCs 凋亡。而在 SCK 不发情奶牛的肝脏和卵巢组织中，AMPKα 会被激活，这种激活有助于减轻 NEFA 对体外颗粒细胞增殖、类固醇激素合成和线粒体功能障碍的影响。该研究不仅加深了人们对 SCK 影响奶牛繁殖机制的理解，还为改善奶牛繁殖效率提供了新的理论依据和潜在的干预靶点。例如，通过调节 AMPKα 的活性，可能开发出有效的治疗方法，帮助奶牛克服 SCK 带来的繁殖障碍，提高奶牛养殖的经济效益，对整个奶牛养殖行业的发展具有重要意义。