NAIP/NLRC4 炎性小体介导肺成纤维细胞和巨噬细胞焦亡引发急性呼吸衰竭：脓毒症研究新突破

《Cell Reports》：Pyroptosis of pulmonary fibroblasts and macrophages through NLRC4 inflammasome leads to acute respiratory failure

本文聚焦脓毒症中急性肺损伤（ALI）。研究发现，NAIP/NLRC4 炎性小体在巨噬细胞和肺成纤维细胞中高表达，其激活引发的细胞焦亡在 ALI 中起关键作用，这为深入理解脓毒症病理及治疗提供了新方向，值得关注。

　　### 研究背景
NAIP/NLRC4 炎性小体在抵御细菌感染中意义重大，可识别细菌鞭毛蛋白等，激活后诱导炎症反应，产生白细胞介素（IL）-1β 和 IL-18 等，限制细菌在巨噬细胞内增殖 ，保护机体免受感染。然而，过度激活会引发细胞因子风暴、凝血障碍和组织损伤。

急性肺损伤（ALI）及其严重形式急性呼吸衰竭（ARF）是脓毒症患者死亡的重要原因。ARF 以肺毛细血管内皮细胞通透性增加和上皮表面功能障碍为特征，ALI 伴有肺部炎症浸润和促炎细胞因子增多，但脓毒症中炎症导致肺损伤的机制尚不明确。

研究目的

探究 NAIP/NLRC4 炎性小体激活与脓毒症中急性肺损伤的关系，明确相关细胞焦亡在其中的作用机制，为脓毒症治疗提供新的理论依据。

实验设计

1. 动物模型：选用野生型（WT）、caspase-1 缺陷型、Gasdermin D（GSDMD）缺陷型、NAIP 缺陷型、NLRC4 缺陷型、TLR5 缺陷型等多种基因编辑小鼠，以及通过杂交获得的特定细胞类型基因缺陷小鼠，如成纤维细胞特异性 GSDMD 缺陷小鼠等。
2. 细胞实验：使用小鼠原代骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）、肺上皮细胞、肺内皮细胞、肺成纤维细胞等，部分细胞系购自商业公司，部分为原代分离培养。
3. 干预措施：给小鼠注射细菌鞭毛蛋白（如 LFn-flagellin 与 PA 结合物）、大肠杆菌 T3SS 杆蛋白（LFn-EprJ）等激活 NAIP/NLRC4 炎性小体；用氯膦酸盐脂质体耗竭小鼠体内单核细胞和巨噬细胞；使用特定抗体（如 1H1 抗 TF 抗体）阻断组织因子（TF），用 IL-1 受体拮抗剂（如阿那白滞素）阻断 IL-1 信号通路。

实验结果

1. 细菌鞭毛蛋白导致小鼠 ALI：注射 LFn-flagellin/PA 可诱导 WT 小鼠产生 p20 caspase-1 和焦亡，导致小鼠死亡、动脉血氧饱和度（SpO₂）下降、肺毛细血管滤过系数（K_f,c）升高，而 caspase-1 缺陷型小鼠可免受这些影响，表明鞭毛蛋白通过炎性小体途径诱导急性呼吸损伤。
2. 鞭毛蛋白诱导的肺损伤依赖 NAIP/NLRC4 炎性小体：NAIP1–6 缺陷型小鼠在注射 LFn-flagellin/PA 后，未出现死亡和急性呼吸损伤，而 TLR5 缺陷型小鼠仍会出现，且不同细菌来源的鞭毛蛋白对肺损伤作用不同，证实急性呼吸损伤至少部分通过炎性小体途径发生。
3. 鞭毛蛋白诱导的肺损伤依赖焦亡：注射 LFn-flagellin/PA 可使 WT 小鼠出现凝血病或弥散性血管内凝血（DIC），但预先用 1H1 抗体阻断 TF 虽能预防 DIC，却不影响 SpO₂水平。GSDMD 缺陷型小鼠可免受鞭毛蛋白诱导的致死性、ALI 和内皮屏障功能破坏，而 IL-1 受体拮抗剂阿那白滞素对鞭毛蛋白诱导的 ARF 无影响，表明焦亡而非 IL-1 信号在炎性小体激活后的 ALI 中起主要作用。
4. 鞭毛蛋白诱导的肺损伤不止巨噬细胞焦亡：注射 LFn-flagellin/PA 后，小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中巨噬细胞浓度降低，IL-6 浓度升高，白细胞募集增加。用氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞后，对鞭毛蛋白诱导的 SpO₂下降改善不明显。体外实验显示，总肺细胞与 LFn-flagellin/PA 孵育可诱导焦亡和 caspase-1 激活，但肺上皮细胞和内皮细胞与 LFn-flagellin/PA 孵育未发生焦亡。
5. 肺成纤维细胞焦亡促进鞭毛蛋白诱导的肺损伤：单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）发现，注射 LFn-flagellin/PA 后，肺中免疫细胞增加，巨噬细胞和部分结构细胞减少。肺成纤维细胞在与 LFn-flagellin/PA 孵育后发生焦亡，且表达 NAIP/NLRC4 炎性小体的所有成分，而其他组织来源的成纤维细胞则不表达。成纤维细胞特异性 GSDMD 缺陷小鼠在巨噬细胞耗竭后，对鞭毛蛋白诱导的肺损伤有显著保护作用。
6. 高剂量鞭毛蛋白诱导的 ALI 涉及巨噬细胞通过 caspase-8/GSDME 途径的焦亡：高剂量（10 μg）LFn-flagellin/PA 可导致 caspase-1 缺陷型小鼠死亡和急性呼吸损伤，但 NAIP1–6 或 NLRC4 缺陷型小鼠可免受影响。高剂量鞭毛蛋白可诱导 caspase-1 缺陷型小鼠总肺细胞死亡，但不诱导肺成纤维细胞死亡。巨噬细胞耗竭可防止 caspase-1 缺陷型小鼠因高剂量鞭毛蛋白导致的 SpO₂下降，且 GSDMD 和 GSDME 双缺陷型小鼠可免受高剂量鞭毛蛋白诱导的 ALI，表明巨噬细胞通过 caspase-8/GSDME 途径的焦亡也参与高剂量鞭毛蛋白诱导的 ALI。
7. 正压机械通气延长鞭毛蛋白攻击小鼠的存活时间：对注射 10 μg LFn-flagellin/PA 的小鼠进行正压机械通气，可延长 WT 和 caspase-1 缺陷型小鼠的存活时间，表明炎性小体激活导致的死亡源于 ARF。在沙门氏菌感染和粪便诱导的腹膜炎（FIP）脓毒症模型中，NLRC4 缺陷型小鼠的肺损伤减轻，存活率提高。

研究结论

1. 本研究揭示了 NAIP/NLRC4 炎性小体在肺成纤维细胞中的高表达，且其激活引发的肺成纤维细胞焦亡会导致 ALI，进而引发呼吸衰竭和宿主死亡，拓展了对 NAIP/NLRC4 炎性小体在感染性疾病中作用的认识。
2. 明确了焦亡在炎性小体激活后 ALI 中的关键作用，且发现肺成纤维细胞和巨噬细胞的焦亡共同促进肺损伤。同时，确定了高剂量鞭毛蛋白诱导 ALI 时，巨噬细胞通过 caspase-8/GSDME 途径发生焦亡的机制。
3. 证实了急性呼吸衰竭是脓毒症患者死亡的重要原因，NAIP/NLRC4 炎性小体激活引发的急性呼吸损伤在脓毒症病理过程中起关键作用，为脓毒症的治疗提供了潜在的新靶点和理论基础 。不过，本研究基于小鼠脓毒症模型，未来还需进一步研究其他细胞类型在脓毒症肺损伤中的作用，并开发针对人类样本的检测方法，以更好地明确焦亡在脓毒症中的生理意义和相关性。