单细胞测序揭示高 ESM1 表达内皮细胞亚群与膀胱癌进展及免疫抑制微环境的关联

《Scientific Reports》：Single-cell sequencing uncovers a high ESM1-expression endothelial cell subpopulation associated with bladder cancer progression and the immunosuppressive microenvironment

膀胱癌（BC）治疗策略虽有进展，但部分患者仍预后不佳。为探究肿瘤内皮细胞（ECs）异质性及功能，研究人员分析单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，发现高 ESM1 表达的 S1 ECs 亚群，其与不良预后和免疫抑制微环境相关，为膀胱癌治疗提供新策略。

　　膀胱癌，作为泌尿系统常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。在 2022 年，全球约有 610,000 例新诊断的膀胱癌病例，超过 220,000 人因该疾病失去生命。目前，膀胱癌的治疗面临诸多困境。对于非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者，尽管接受了经尿道切除术及后续膀胱内化疗或免疫治疗，仍有许多人会复发并进展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC），预后较差。而对于 MIBC 患者，顺铂化疗效果有限，免疫检查点抑制剂治疗部分患者反应不佳。因此，深入了解膀胱癌复发和进展的机制，探索新的治疗靶点迫在眉睫。

肿瘤微环境（TME）中的非癌细胞及其分泌因子在癌症发展中起着关键作用，其中内皮细胞（ECs）对肿瘤血管生成和转移至关重要。肿瘤 ECs 与正常 ECs 存在差异，且具有显著异质性，不同亚群对肿瘤进展影响不同。然而，膀胱癌中肿瘤相关 ECs 的异质性及其与癌细胞的相互作用尚不明确。

深圳大学等研究机构的研究人员开展了一项关于膀胱癌中肿瘤相关 ECs 的研究。他们通过对 scRNA-seq 数据进行全面分析，发现了一个此前未被识别的高 ESM1 表达的 EC 亚群，并深入探究其在膀胱癌中的作用。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为膀胱癌的治疗和预后评估提供了重要依据。

研究人员运用了多种关键技术方法。数据方面，获取了多个单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集，包括 GSE211388 等，以及单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）数据和批量 RNA 测序（bulk RNA-seq）数据，还从公共数据库获取临床特征数据。分析方法上，利用 “Seurat” 包处理 scRNA-seq 和 snRNA-seq 数据，采用多种算法去除低质量细胞、污染及批次效应；通过 “muscat” 包进行差异表达分析，用 “ClusterProfiler” 包进行通路富集分析，借助 “Monocle” 包构建细胞发育轨迹，运用 pySCENIC 分析基因调控网络等。

研究结果如下：

1. 单细胞分析揭示膀胱癌中两种不同的 EC 亚群：分析 CD45 阴性基质细胞的 scRNA-seq 数据，经筛选得到 7,519 个高质量细胞，识别出 12 个不同细胞簇，其中 705 个内皮细胞被分为 S1 ECs 和 S2 ECs 两个亚群。S1 ECs 高表达 ESM1 等血管生成相关基因，S2 ECs 高表达 CXCL2 等免疫相关基因。功能富集分析表明，S1 ECs 与肿瘤促进信号通路相关，S2 ECs 与免疫反应相关。整合其他 scRNA-seq 数据集进一步验证了这两个亚群的存在及特征。
2. 高 ESM1 表达 EC 亚群的转录和功能特征：计算 AUCell 分数评估信号通路活性，发现 S1 ECs 中血管生成、NOTCH 信号等通路活性显著增加，S2 ECs 中免疫反应相关通路活性升高。伪时间轨迹分析显示，S2 ECs 主要位于轨迹初始阶段，S1 ECs 位于中末端，且随着伪时间进展，相关基因表达发生变化。基因调控网络（GRN）分析表明，S1 ECs 中与肿瘤进展相关的转录因子活性增加，S2 ECs 中炎症相关转录因子活性高。
3. 高 ESM1 表达 EC 亚群的丰度与膀胱癌预后和免疫细胞浸润相关：分析 snRNA-seq 数据，发现 MIBC 的 ECs 中 S1 ECs 特征分数显著高于正常 ECs。Kaplan-Meier 分析显示，TCGA 和 IMvigor210 队列中，S1 ECs 丰度高的患者总生存期明显缩短，但对免疫治疗客观缓解率无显著影响。免疫细胞浸润分析表明，S1 ECs 特征分数高的患者，巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性 T 细胞浸润增加。
4. ESM1 主要在膀胱癌的内皮细胞中表达：snRNA-seq 数据显示，MIBC 的 ECs 中 ESM1 表达显著上调，且为 MIBC-EC 相关差异表达基因、S1 ECs 标记基因和 ETV5 靶基因的交集。免疫组化染色验证了 ESM1 主要在膀胱癌组织的内皮细胞中表达。
5. 重组人 ESM1 蛋白促进膀胱癌细胞的增殖和迁移：用重组人 ESM1 处理膀胱癌细胞系 UMUC-3 和 5637，EdU 掺入实验和 Transwell 实验表明，rhESM1 显著促进细胞增殖和迁移。
6. 膀胱癌中 MIBC-EC 相关预后模型的建立和验证：比较肿瘤 ECs 和正常 ECs 的基因表达谱，鉴定出 244 个差异表达基因（DEGs）。经单变量 Cox 回归、LASSO 回归和逐步 Cox 回归分析，建立了基于 6 个预后基因的风险模型。在多个队列中验证，高风险组患者总生存期明显短于低风险组，该模型有较好的预测性能。
7. 新列线图的构建和验证：单变量和多变量 Cox 回归分析显示，MIBC-EC 相关风险评分、病理 T 分期和年龄是膀胱癌总生存期的独立预测因子。构建包含这三个因素的列线图，经评估其具有较好的预测准确性。

研究结论表明，高 ESM1 表达的 EC 亚群与膀胱癌的临床结局和免疫特征密切相关，靶向肿瘤相关 ECs 中的 ESM1 可能是治疗膀胱癌和增强抗肿瘤免疫的有前景的策略。同时，研究人员构建并验证了与 MIBC 内皮细胞相关的预后模型，为预测膀胱癌患者的临床结局提供了新的生物标志物。不过，该研究存在一些局限性，如可能受技术和生物学偏倚影响，需更多大规模临床队列验证，且仅进行了体外实验，未来需进一步研究。但总体而言，该研究为膀胱癌的研究和治疗开辟了新方向，有助于推动膀胱癌治疗领域的发展，为改善患者预后带来新希望。