一种新型永生化人主动脉瓣间质细胞系的建立及其在主动脉瓣钙化疾病研究中的重要意义

《Scientific Reports》：Establishment and characterization of a novel immortalized human aortic valve interstitial cell line

为解决缺乏临床相关细胞模型阻碍对钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）理解的问题，研究人员开展了永生化人主动脉瓣间质细胞（iHAVICs）的建立与特性研究。结果成功建立 iHAVICs，其可诱导成骨表型。该研究为 CAVD 研究提供了体外实验工具。

　　主动脉瓣就像心脏的 “阀门”，对维持心脏正常功能至关重要。然而，钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）却如同隐藏在心脏里的 “定时炸弹”，严重威胁着全球人群的健康。据统计，2017 年全球约有 1260 万例 CAVD 患者，约 10.3 万人因此失去生命。目前，CAVD 早期缺乏特效药物，手术成为重症患者的唯一选择。这就迫切需要深入研究 CAVD 的发病机制，找到有效的治疗靶点。

在主动脉瓣的 “微观世界” 里，主动脉瓣间质细胞（AVICs）与其他细胞和细胞外基质共同构成了主动脉瓣的主要结构。在多种病理条件下，AVICs 会分化成瓣膜衍生的基质细胞（VDSCs），成为瓣膜钙化的主要效应细胞。以往研究常用原代主动脉瓣间质细胞（pHAVICs）来模拟瓣膜钙化过程，但 pHAVICs 存在诸多 “短板”。比如获取样本受限，生长分裂缓慢，传代过程中还容易走向凋亡和衰老，这使得建立特定基因敲低或敲除细胞系困难重重。此外，近年来出现的诱导多能干细胞（iPSCs）虽能部分弥补原代细胞的不足，但诱导分化过程漫长，且所需细胞因子和分选试剂成本高昂，限制了其广泛应用。

为了突破这些困境，华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科的研究人员开展了一项关键研究。他们将目光聚焦在猿猴病毒 40（SV40）的大 T 抗原（LTA）上，通过慢病毒载体将 SV40 - LT 导入 pHAVICs，经过一系列筛选和培养，成功建立了永生化的人主动脉瓣间质细胞系（iHAVICs）。这一成果意义非凡，为 CAVD 的体外研究提供了有力的实验工具，发表在《Scientific Reports》上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。首先，通过获取 9 岁扩张型心肌病患者心脏移植手术中的非钙化主动脉瓣叶，分离出 pHAVICs（样本队列来源）。接着，利用慢病毒转染技术将 SV40 - LT 导入细胞，实现细胞永生化。之后，采用短串联重复序列（STR）分析对 iHAVICs 进行身份鉴定；运用 RNA 测序（RNA - Seq）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）、免疫细胞化学、β - 半乳糖苷酶染色、5 - 乙炔基 - 2′ - 脱氧尿苷（EdU）检测、成骨诱导和茜素红染色等技术，对 iHAVICs 的细胞表型、转录组表达、增殖能力、衰老状态和成骨分化能力等进行全面检测分析 。

研究结果如下：

• iHAVICs 的建立与细胞形态：成功建立 iHAVICs，其稳定表达 SV40 LTA。经 STR 分析，iHAVICs 是区别于现有细胞系的新型细胞系。光学显微镜下，iHAVICs 呈梭形或星形，与 pHAVICs 形态相似，但增殖能力更强。免疫荧光染色显示，iHAVICs 与 pHAVICs 的间质细胞标记物染色位置相似。
• 转录组分析：RNA - Seq 结果表明，与 pHAVICs 相比，iHAVICs 中有 967 个基因上调，88 个基因下调。基因本体论（GO）富集分析发现，永生化处理主要改变了有丝分裂增殖相关基因和细胞骨架相关基因的表达，而主动脉瓣间质细胞标记基因未发生改变。
• p53 通路相关基因表达：qPCR、Western blot 和免疫荧光结果显示，iHAVICs 中 TP53 和 RB1 的转录水平和蛋白水平均显著高于 pHAVICs，且 p53 通路基因大多上调。
• 细胞活力与衰老状态：EdU 检测和细胞计数实验表明，iHAVICs 的增殖速度明显快于 pHAVICs。β - 半乳糖苷酶染色显示，iHAVICs 在传代过程中不易衰老，但在成骨诱导刺激下仍具有衰老潜力。
• 多代传代后的转录组稳定性：对比第 10 代和第 50 代 iHAVICs 的转录组，发现差异表达基因（DEGs）主要富集在炎症、矿物质代谢和脂质代谢途径，但大多数基因表达变化不显著，表明 iHAVICs 在多代传代后转录组表达相对稳定。
• iHAVICs 的成骨分化特性：用多种刺激物诱导 iHAVICs 成骨分化，发现不同刺激物可使 iHAVICs 呈现不同的成骨表型，且成骨标记物表达变化各异。茜素红染色证实了无机磷诱导 iHAVICs 形成钙化结节。RNA - Seq 分析表明，炎症反应相关分子在 iHAVICs 的成骨转化中起重要作用。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功建立并全面表征了 iHAVICs，为 CAVD 的体外研究提供了实用的实验工具。iHAVICs 具有稳定的间质细胞标记物表达、较强的增殖能力和对不同成骨刺激的多样反应。不过，研究也存在一些局限性，如病毒转染可能改变体外模型中钙化的分子机制，iHAVICs 可能受供体效应影响，且未深入探究 SV40T 诱导细胞永生化的机制以及与 iPSCs 的差异。未来还需更多研究来进一步明确原代细胞、iPSCs 和永生化细胞的不同特征。总体而言，这项研究为 CAVD 的研究开辟了新路径，为后续探索疾病发病机制和寻找潜在治疗靶点奠定了坚实基础，有望推动心血管疾病治疗领域的新发展。