新型 NefhCreERT2敲入小鼠：精准靶向有髓初级传入神经元的遗传学利器

《Scientific Reports》：Genetic targeting of myelinated primary afferent neurons using a new NefhCreERT2 knock-in mouse

在体感研究领域，区分无髓和有髓初级传入纤维的遗传工具匮乏。研究人员构建 NefhCreERT2敲入小鼠，该小鼠能高效特异性地重组有髓纤维相关报告基因。这为有髓初级传入纤维亚群的交叉靶向研究提供了重要遗传工具。

　　在人体的神经系统中，初级传入神经元（PAFs）就像一个个 “通讯兵”，负责传递躯体感觉信息。其中，有髓鞘的 A 纤维和无髓鞘的 C 纤维是两大主要 “阵营”，它们分工不同，功能各异。一直以来，科学家们都致力于根据这些神经元所服务的躯体感觉模式，对背根神经节（DRG）中的神经元群体进行分类。随着技术的进步，单细胞 RNA 测序研究虽然发现了不同物种中独特的神经元簇，但对这些神经元簇及其亚簇进行功能和解剖学特征分析时，却遇到了重重阻碍。

这主要是因为缺乏能精准靶向特定神经元群体的独特遗传标记。而且，其他组织尤其是神经系统其他部分存在相似的基因表达，使得基于单一标记的遗传操作变得复杂。此外，虽然人们早就知道有髓和无髓感觉神经元之间的区别具有重要功能意义，但一直没有可靠的遗传工具来区分这两种神经元群体。

为了解决这些问题，来自瑞典林雪平大学（Link?ping University）的研究人员展开了深入研究。他们成功构建并表征了一种新型 Nefh^CreERT2敲入小鼠品系，这一研究成果发表在《Scientific Reports》上。该研究意义重大，为精准研究有髓 PAFs 提供了关键工具，有望推动躯体感觉神经元亚群的功能和解剖学特征研究取得新进展。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术，利用标准的 CRISPR/Cas9 方法在 C57Bl/6J 小鼠背景上构建了 Nefh^CreERT2敲入小鼠品系；其次，采用免疫荧光技术，通过标记不同的蛋白来观察神经元的特征；还有原位杂交技术，用于检测基因的表达情况；电子显微镜技术则帮助研究人员观察神经元的超微结构；体内成像技术借助与 RCL-GCaMP6f 小鼠杂交，实现对 DRG 神经元生理反应的测量。

在研究结果部分，研究人员首先对 Nefh^CreERT2小鼠的重组情况进行了验证。实验显示，给幼年小鼠注射一次 2mg 他莫昔芬（tamoxifen），就能在 NFH⁺的 DRG 神经元中实现高效（>85%）且高选择性（>95%）的重组；而注射 20μg 他莫昔芬则可用于稀疏标记这类神经元。通过对 L3-L5 DRG 神经元的分析发现，表达 tdTomato 的神经元多为中大型，与已知的有髓 PAFs 特征相符。

在对有髓 PAFs 的形态学和功能特征进行研究时，研究人员将 Nefh^CreERT2小鼠与多种报告小鼠品系杂交。在皮肤中，tdTomato⁺纤维形成围绕毛囊的环形和柳叶形末梢，还与迈斯纳小体（Meissner corpuscles）相关联；在脊髓中，运动神经元出现重组，而其他灰质区域神经元重组较少，轴突在背柱和特定层中分布密集。电子显微镜下，有重组相关过氧化物酶标记的神经末梢具有有髓初级传入末梢的形态特征。

在对有髓 PAFs 的生理反应研究中，研究人员通过体内 Ca²⁺成像发现，S1 神经节中的 GCaMP6f 表达神经元对多种低阈值机械刺激反应活跃，对温度刺激反应较少。并且，在 Nefh^CrefERT2;GCaMP6f 小鼠中，低阈值机械感受器（LTMRs）在响应细胞中的比例显著高于泛 GCaMP6f 表达小鼠。

综合研究结果和讨论部分，Nefh^CreERT2小鼠品系是一种通用且选择性高的工具，能精准靶向有髓 PAFs，排除无髓 C 纤维的干扰。虽然在中枢神经系统（CNS）中也存在一定程度的重组，但可通过交叉靶向策略解决。这一研究成果为躯体感觉神经元亚群的功能和解剖学特征研究提供了重要的遗传工具，有助于深入了解躯体感觉的神经机制，为相关神经系统疾病的研究和治疗提供了新的思路和方向。