高通量测序技术在低细胞背景高病毒载量样本中的病毒检测性能评估：一项多实验室验证研究

《npj Vaccines》：Virus detection by short read high throughput sequencing in a high virus low cellular background

本期推荐：七家国际实验室采用短读长高通量测序(HTS)技术，系统评估了腺病毒5型(Ad5)基质中五种参考病毒(EBV/FeLV/RSV/Reo1/PCV1)的检测灵敏度。研究证实HTS在106 GC/mL浓度下可100%检出所有病毒，部分实验室甚至达到≤102 GC/mL的灵敏度。该成果为生物制品病毒安全性检测提供了标准化验证方案，推动HTS替代传统动物实验的进程。

　　在生物制药领域，确保疫苗和生物制剂不含外源病毒污染是产品安全性的核心要求。传统检测方法如体外细胞培养和动物实验存在周期长、灵敏度有限等缺陷，而聚合酶链反应(PCR)等分子检测又受限于靶标预知性。高通量测序(HTS)技术的出现为解决这一难题带来了曙光——这种无需预设靶标的技术理论上能检测所有核酸序列，但其在实际应用中的检测性能和标准化程度仍需系统验证。

美国食品药品监督管理局(FDA)生物制品评价与研究中心的Arifa S. Khan团队联合全球6家机构，在《npj Vaccines》发表了这项开创性研究。研究人员设计了一套严谨的多中心验证方案：以高纯度腺病毒5型(Ad5，1-5×10⁹ GC/mL)为基质，掺入五种特性各异的参考病毒（EBV、FeLV、RSV、Reo1和PCV1），浓度梯度设置为10¹-10⁶ GC/mL。七家实验室使用独立的工作流程，涵盖核酸提取、文库构建、Illumina平台测序及生物信息学分析全环节，通过靶向和非靶向两种分析策略系统评估检测性能。

关键技术方法包括：1) 使用CBER NGS Virus Reagents标准品建立不同浓度梯度；2) 采用酚氯法或商业试剂盒(QIAamp)提取核酸；3) 差异化处理DNA/RNA（分步或同步建库）；4) Illumina短读长测序（NextSeq/HiSeq）；5) 双盲生物信息学分析（BWA-MEM比对、RVDB数据库筛查）；6) 检测限(LOD)计算与线性评估。

研究结果部分呈现了丰富的数据发现：

1. "HTS targeted analysis"显示：所有实验室在10⁶ GC/mL水平均能检出全部五种病毒；75%实验室在10⁴ GC/mL保持100%检出率；最低检测限达10² GC/mL（实验室5）。值得注意的是，EBV表现出最优异的检出稳定性，而Reo1（双链RNA病毒）的检测波动性最大（r²=0.36），提示dsRNA病毒需要特殊处理优化。

2. "Non-targeted HTS bioinformatic analyses"证实：基于RVDB数据库的非靶向分析同样在10⁶ GC/mL实现全病毒检出，但低浓度样本（10² GC/mL）的检出一致性降低。意外发现是，所有实验室均检测到病毒原料中存在的污染物——食蟹猴逆转录病毒(SMRV)和猪内源性逆转录病毒(PERV)，证实HTS可同步监控生产细胞系残留风险。

3. "HTS detection of unexpected virus sequences"揭示：非靶向分析能识别出21类非预期病毒信号，包括牛血清相关病毒（如ungulate copiparvovirus 5）和生产细胞系内源序列（如HERV）。这些发现凸显了建立科学判读标准的重要性——例如实验室4通过NT数据库比对，排除了HIV-1假阳性信号（实际为人源非病毒序列）。

4. "Linearity and detection limits"数据显示：不同病毒基因组类型的检测线性存在显著差异。DNA病毒PCV1和EBV呈现良好剂量效应（r²>0.8），而分段基因组病毒Reo1的线性最差（r²=0.36），这种差异主要归因于样本前处理环节对不同核酸结构的提取效率差异。

在讨论环节，作者深刻指出该研究的三大里程碑意义：首先，这是首次系统评估HTS在模拟疫苗原液（高病毒载量/低细胞背景）中的检测性能，为ICH Q5A(R2)指南实施提供了关键数据支持。其次，研究揭示了工作流程优化方向——如单独cDNA合成步骤可提升RNA病毒检出率，而超速离心在纯化样本中增益有限。最重要的是，研究建立的CBER NGS Virus Reagents标准品体系（现可通过BEI Resources获取）为全球实验室方法验证提供了统一标尺。

这项研究也存在若干局限：未评估复杂基质（如细胞培养上清）的检测性能；各实验室采用的生物信息学阈值不统一；缺乏大规模重复验证。作者建议未来研究应聚焦三个方向：建立跨平台判读标准、开发长读长测序方案、拓展至细胞治疗产品检测。随着这些工作的推进，HTS技术有望彻底革新生物制品安全监管体系，实现从"有限检测"到"全景监控"的范式转变。