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在植物受精过程中，助细胞程序性死亡（PCD）对防止多精受精至关重要，但相关分子机制不明。华中师范大学等研究人员以玉米为对象，探究助细胞退化过程。结果发现受精诱导的 ZmRALF12 肽引发线粒体 ROS 产生和乙烯信号传导，促进助细胞死亡。该研究揭示了植物 dPCD 机制，为相关研究提供资源。
在植物的繁衍过程中，受精是极为关键的一环。就像一场精心编排的生命之舞，花粉管努力寻找着卵子，完成受精使命。然而，在这个过程里，有一个现象一直困扰着科学家们：受精后，多余的花粉管要是继续进入，就会导致多精受精，这对植物的后代健康有着极大的危害。为了避免这种情况，植物需要及时让多余的花粉管不再进入，而这其中的关键就在于让助细胞程序性死亡（Programmed Cell Death，PCD）。PCD 在植物生长发育中十分常见，它能像 “清道夫” 一样，去除那些受损或者不再需要的细胞，对植物的繁殖和种子生产起着不可或缺的作用。在开花植物的受精过程里，助细胞的及时退化对于成功受精意义重大。可是，尽管这个过程如此重要，目前人们对于控制助细胞 PCD 的基因调控网络却知之甚少，尤其是持久助细胞（persistent synergid cell）的退化机制，一直是个未解之谜。
为了揭开这个谜团，华中师范大学和德国雷根斯堡大学的研究人员携手开展了一项深入研究。他们以玉米为研究对象，因为玉米是一种重要的农作物，研究它的受精机制不仅有助于深入理解植物的繁殖过程，还可能为提高农作物产量提供理论依据。研究人员克服了诸多技术难题，成功开发出分离玉米特定阶段助细胞的方法，进而系统地探索助细胞的退化过程以及背后的分子机制。
研究人员运用了多种关键技术方法。首先是转录组测序技术，通过对不同阶段助细胞进行 RNA 测序，分析基因表达的动态变化，了解助细胞退化过程中的基因调控网络。其次，利用 CRISPR-Cas9 技术构建了 zmralf12 突变体，以此探究 ZmRALF12 基因在助细胞退化中的功能。此外，还运用了双荧光素酶报告基因检测技术，验证转录因子对基因表达的调控作用；通过免疫荧光技术，观察蛋白的定位和表达情况 。
下面来看具体的研究结果：
- 持久助细胞退化的时间及 RNA-seq 数据：研究人员借助助细胞标记系 pZmES4::ZmES4-GFP 和自交系 B73，观察到持久助细胞在授粉后 25 - 26 小时左右完全消失，这大约是受精后 17 - 18 小时。之后，他们成功分离出不同阶段的助细胞，包括授粉前、受精后不久、细胞退化期和细胞消除前不久的助细胞，并生成了高时间精度的退化阶段特异性转录组数据。通过分析这些数据发现，在持久助细胞中，许多基因在受精后发生了显著变化，且主要的 PCD 相关激活波在受精后较晚出现，就在持久助细胞消除前的几个小时内。
- 助细胞和卵细胞的细胞特异性基因表达图谱：对授粉前玉米助细胞基因表达模式的分析显示，助细胞具有典型的腺细胞特征，大量基因编码分泌蛋白，而相邻的卵细胞则为胚胎发育做准备，富含线粒体蛋白和核糖体转录本。此外，多数高表达基因具有助细胞特异性，其中部分编码小分泌肽和细胞壁修饰蛋白，这些蛋白可能在双受精过程中发挥重要作用。
- 助细胞退化过程中助细胞特异性 GRN 的丧失：研究发现，受精后助细胞中大部分高表达基因的表达量显著下降，其中包括许多受转录因子调控的基因。以 ZmMYB98 为例，它是玉米助细胞中表达量最高的转录因子基因之一，在助细胞退化过程中表达持续下降。通过双荧光素酶报告基因检测和其他实验证实，ZmMYB98 能调控多数助细胞特异性高表达基因，受精后这一调控网络迅速下调，在细胞消除前几乎关闭。
- ZmRALF12 对丝状器邻近区域 ROS 产生的作用：ROS 作为重要的信号分子，参与植物许多生理过程，也与细胞死亡密切相关。研究人员通过染色实验发现，受精诱导持久助细胞在丝状器邻近区域（filiform apparatus adjacent region，FAAR）产生颗粒状 ROS，且其积累在细胞退化前达到高峰。进一步研究表明，ZmRALF12 肽在受精后诱导产生，是触发 ROS 产生的关键因素，zmralf12 突变体中该区域 ROS 不再诱导产生。
- ZmRALF12 触发线粒体 ROS 产生：体外实验表明，ZmRALF12 能够诱导助细胞线粒体 ROS 产生和积累，且这一过程依赖于 NADPH 氧化酶（RBOH）和 Ca2+通道活性。用 ZmRALF12 处理未授粉的助细胞，能观察到 ROS 和线粒体信号在 FAAR 区域显著积累，且 ROS 产生区域与线粒体共定位。
- ZmRALF12 触发的 mitoROS 产生介导持久助细胞的氧化应激和 dPCD：随着 ZmRALF12 表达增加和线粒体 ROS 积累，持久助细胞发生氧化应激，相关基因表达发生变化，抗氧化酶基因下调，而参与氧化应激反应和衰老的基因上调。同时，在细胞消除前观察到活跃的自噬过程，ZmRALF12 能有效触发自噬体产生和液泡积累，表明它能激活持久助细胞的 dPCD 通路。
- ZmRALF12 触发的 mitoROS 和乙烯促进致敏助细胞死亡：由于线粒体抗氧化酶在受精后下调，持久助细胞对 ROS 积累更加敏感。研究发现，去除 ROS 会延迟助细胞死亡，而乙烯在助细胞中特异性激活，外施乙烯能诱导助细胞死亡，而对周围细胞无影响。这表明 ZmRALF12 触发的线粒体 ROS 积累和乙烯信号传导协同作用，促进了受精后致敏助细胞的死亡。
- 持久助细胞的 PCD 在受精后延迟激活：通过对玉米胚珠的观察发现，持久助细胞在授粉后 25 - 26 小时左右与胚乳融合并消失，这一过程伴随着细胞核的解体等 PCD 特征。进一步研究发现，许多 PCD 相关转录因子和执行蛋白在受精后 18 - 24 小时被激活，包括 ZmKIL1、ZmKIL2、ZmNAC087L1 - 4、ZmCEP1 和 ZmVPEγ 等，同时还有一些参与 PCD 调控的基因也被激活，这表明 PCD 在助细胞 - 胚乳融合（synergid - endosperm fusion，SE 融合）前被激活，最终导致助细胞消除。
综合上述研究，该研究揭示了植物受精过程中持久助细胞程序性死亡的分子机制。受精诱导的 ZmRALF12 肽通过触发线粒体 ROS 产生，介导氧化应激，激活 dPCD 通路；同时，乙烯信号传导也在这一过程中发挥重要作用，二者协同确保了持久助细胞的及时解体和消除，防止多精受精，保证了植物的正常繁殖。这一研究为深入理解植物发育程序性细胞死亡提供了重要依据，也为进一步研究植物繁殖过程中的其他关键分子机制提供了丰富的资源，对植物学基础研究和农业生产实践都有着重要的意义。
