基因组规模CRISPRi筛选揭示pcnB抑制赋予大肠杆菌游离脂肪酸高效合成的生理优势

编辑推荐：为解决微生物合成游离脂肪酸(FFAs)过程中生理限制的瓶颈问题，研究人员通过基因组规模CRISPRi筛选结合FACS/NGS技术，发现抑制poly(A)聚合酶基因pcnB可增强质子消耗系统基因稳定性，改善膜特性、氧化还原状态和能量水平，使工程菌株pcnB-acrD-fadR+在分批补料发酵中达到35.1 g L-1的FFAs产量，创下大肠杆菌最高记录，为微生物生理工程提供了新策略。

　　微生物合成游离脂肪酸(FFAs)作为生物燃料和药品的理想原料，其工业化生产面临生理限制的瓶颈。传统理性改造和随机突变方法效率低下，且微生物生理网络的复杂性使得关键调控靶点难以系统识别。针对这一挑战，中国科学院天津工业生物技术研究所的Lixia Fang、Xueyan Hao、Yingxiu Cao团队在《Nature Communications》发表研究，通过创新性整合基因组规模CRISPR干扰(CRISPRi)技术、荧光激活细胞分选(FACS)和二代测序(NGS)，揭示了调控FFAs合成的关键生理决定因子。

研究采用三项核心技术：1)构建包含55,671个sgRNA的基因组规模CRISPRi文库进行全基因组扰动；2)利用尼罗红染色结合FACS分选高产FFAs的细胞群体；3)通过NGS分析排序前后sgRNA分布变化鉴定关键基因。这些方法实现了从海量遗传变异中高效筛选表型优势基因。

研究首先通过全基因组筛选发现，抑制编码poly(A)聚合酶I的pcnB基因可使FFAs产量提升3.9倍。深入机制研究表明，pcnB抑制减少了gadAXE转录本的poly(A)尾介导的降解，增强其稳定性。这些转录本编码谷氨酸依赖的酸抵抗系统(GAD)组分，其上调促进了质子消耗，进而改善三个关键生理指标：膜完整性（PI阴性细胞从58%增至88%）、氧化还原状态（ROS降低88%）和能量水平（ATP增加52-111%）。在此基础上，第二轮筛选鉴定出外排转运蛋白acrD作为协同靶点，其抑制释放TolC/AcrA资源增强FFAs外排。最终构建的pcnB-acrDⁱ-fadR⁺工程菌在5L发酵罐中实现35.1 g L^-1的FFAs产量，创下大肠杆菌最高记录且生产率达0.84 g L^-1 h^-1。

这项研究的突破性在于：1)首次建立生理特性与FFAs合成的直接分子联系，揭示pcnB作为"生理调节枢纽"通过RNA稳定性调控全局生理状态；2)开发"CRISPRi-FACS-NGS"三位一体筛选平台，为复杂生理性状的工程改造提供范式；3)证明组合靶向RNA代谢（pcnB）与转运系统（acrD）可协同突破产量极限。该策略在五种大肠杆菌菌株和两种碳源中均显示普适性，为微生物细胞工厂的理性设计开辟了新途径。研究不仅解决了FFAs合成的实际问题，更提出了"生理组工程"的新概念，即通过系统识别隐藏的生理决定因子来释放微生物合成潜力，这一理念可拓展至其他高价值化合物的生物制造。