揭秘细胞迁移 “密码”：细胞外渗透压通过 TRPV4 - Rho/ROCK 信号通路调控成骨细胞迁移

《Communications Biology》：Extracellular osmolarity regulates osteoblast migration through the TRPV4-Rho/ROCK signaling

为探究细胞外渗透压对成骨细胞迁移的影响，研究人员以 MC3T3 - E1 细胞系为模型开展研究。结果表明，细胞外渗透压显著影响成骨细胞迁移，低渗促进、高渗抑制，且通过 TRPV4 - Rho/ROCK 信号通路调控。这为理解骨重塑机制提供新视角。

　　在骨骼的 “微观世界” 里，成骨细胞（osteoblasts）如同勤劳的 “工匠”，对维持骨骼的健康与完整起着关键作用。它们从间充质干细胞分化而来，承担着合成和矿化骨基质的重任，参与骨骼的形成、重塑与修复过程。在骨形成的 “旅程” 中，成骨细胞需要精准地迁移到特定位置，这一过程就像细胞在身体里进行一场复杂的 “导航旅行” 。然而，在这个 “旅行” 过程中，成骨细胞所处的细胞外液环境会不断变化，其中细胞外渗透压（extracellular osmolarity）作为细胞外液环境的关键因素，对细胞的形态和功能有着重要影响。尽管此前研究揭示了机械拉伸、流体剪切应力等机械因素对成骨细胞的作用，但细胞外渗透压对成骨细胞迁移的影响却知之甚少。在成骨细胞迁移过程中，其周围的细胞外渗透压可能因体液环境的改变而波动，比如从骨髓迁移到目标区域时，会接触到血液、淋巴液和骨间质液等不同渗透压的液体；而且，当骨骼受伤时，局部的炎症反应、液体渗出等也会导致渗透压变化。因此，探究细胞外渗透压对成骨细胞迁移的影响机制，对于深入理解骨重塑过程、治疗骨骼疾病具有重要意义。

为了解开这个谜团，北京大学第三医院康复医学科和中国科学院力学研究所的研究人员携手开展了一项研究，相关成果发表在《Communications Biology》上。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：选用 MC3T3 - E1 细胞系作为成骨细胞模型进行细胞培养；利用伺服零法（servo - null method）测量细胞内压力；通过活细胞工作站的延时成像（time - lapse imaging）、伤口愈合实验（wound healing assay）和 Transwell 实验评估细胞迁移能力；运用免疫荧光染色（immunofluorescence staining）观察细胞骨架结构和黏着斑（focal adhesions，FAs）形成；采用蛋白质免疫印迹（western blot）和定量实时聚合酶链反应（qRT - PCR）检测相关蛋白和基因的表达水平 。

研究结果如下：

1. 细胞外渗透压影响成骨细胞迁移：研究人员将用 Hoechst 33342 标记的贴壁 MC3T3 - E1 细胞置于不同渗透压的培养基中，通过延时成像监测细胞迁移。结果发现，在低渗培养基中，成骨细胞迁移距离显著长于等渗培养基，而在高渗培养基中迁移距离最短；低渗培养基中细胞平均迁移速度最高，达到 0.09μm 每分钟，等渗培养基中约为 0.06μm 每分钟，高渗培养基中约为 0.05μm 每分钟。伤口愈合实验和 Transwell 实验也进一步证实，低渗条件加速成骨细胞集体迁移和伤口闭合，高渗环境则显著减缓这一过程，且细胞更倾向于向低渗环境迁移。同时，细胞凋亡分析表明，不同渗透压在 24 小时内对细胞凋亡率无显著影响，突出了细胞外渗透压对成骨细胞迁移的作用。
2. 细胞外渗透压调节成骨细胞的黏着斑、应力纤维和极性：研究人员用鬼笔环肽（phalloidin）标记细胞，观察细胞骨架结构。结果显示，低渗培养基促进应力纤维形成，高渗培养基则不利于其形成；细胞骨架对渗透压刺激响应迅速，3 小时时不同组间差异最明显，24 小时时差异逐渐减小。用桩蛋白（paxillin）染色发现，低渗培养基中 FAs 数量大幅增加，高渗培养基中减少 。通过分析细胞纵横比评估极性变化，发现等渗培养基中细胞平均纵横比约为 2.7，低渗培养基中增加到约 5.4，高渗培养基中降低到约 2.0 。进一步量化应力纤维方向发现，低渗培养基中应力纤维倾向于与细胞长轴平行排列，随着渗透压升高，其角度分布逐渐分散。这表明细胞外渗透压在 FAs、应力纤维形成和细胞极性发展中起重要作用。
3. 成骨细胞通过 TRPV4 通道感知细胞外渗透压变化：由于细胞膜具有半透性，细胞外渗透压变化会引起水通量改变，导致细胞内压力变化。研究人员用伺服零法测量不同渗透压培养基中 MC3T3 - E1 细胞的细胞内压力，发现低渗培养基中细胞内压力升高，高渗培养基中降低。考虑到细胞内压力升高会影响细胞膜拉伸，激活钙通道，而 TRPV4（Transient Receptor Potential Vanilloid 4）通道可响应膜拉伸且是细胞体积调节的关键因子，研究人员检测了低渗冲击下 MC3T3 - E1 细胞的钙离子浓度变化。结果显示，低渗冲击下细胞钙离子浓度迅速升高，约 20 秒达到峰值后逐渐下降，而用 TRPV4 拮抗剂 HC067047 抑制 TRPV4 通道后，钙离子浓度升高明显受到抑制，这表明成骨细胞主要通过 TRPV4 通道响应细胞外渗透压变化。
4. TRPV4 在调节成骨细胞迁移中起关键作用：研究人员通过抑制 TRPV4 通道，利用活细胞追踪、伤口愈合和 Transwell 实验评估细胞迁移。结果显示，抑制 TRPV4 显著降低成骨细胞迁移能力。同时，在低渗处理的同时抑制 TRPV4，应力纤维形成和 FAs 数量明显减少；在高渗处理的同时激活 TRPV4，应力纤维形成增加，FAs 数量增多。分析细胞纵横比发现，抑制低渗培养基中的 TRPV4 会降低细胞纵横比，激活高渗培养基中的 TRPV4 会使纵横比略有增加。统计应力纤维方向发现，抑制低渗培养基中的 TRPV4 会使应力纤维排列分散，激活高渗培养基中的 TRPV4 会使应力纤维更靠近细胞长轴排列。这些结果表明 TRPV4 在成骨细胞迁移中起关键作用。
5. Rho/ROCK 信号在成骨细胞迁移和极性中起关键作用：鉴于 Rho/ROCK 信号通路在调节肌动蛋白动力学和 FAs 形成中的重要作用，且其与 TRPV4 密切相关，研究人员用针对 Rho/ROCK 通路组分的抑制剂处理细胞，再进行低渗冲击。结果显示，抑制 Rac GTPase、Cdc42 GTPase 和 ROCK 激酶后，成骨细胞迁移显著受抑制，应力纤维形成和 FAs 数量减少，细胞纵横比降低，应力纤维排列分散，表明 Rho/ROCK 信号通路在调节成骨细胞的细胞骨架动力学和迁移中起重要作用。
6. 细胞外渗透压通过 TRPV4 - Rho/ROCK 信号调节成骨细胞迁移：研究人员通过 western blot 和 qRT - PCR 分析发现，低渗培养基使 TRPV4 表达增加，高渗培养基使其表达降低。PCR 分析显示，低渗处理上调 CDC42 和 RAC1 表达，高渗处理下调其表达；抑制低渗处理中的 TRPV4 会降低 CDC42 表达，激活高渗处理中的 TRPV4 会增加 CDC42 和 RAC1 表达。这表明细胞外渗透压影响 TRPV4 表达，TRPV4 作为 Rho/ROCK 信号通路的上游调节因子，参与调节成骨细胞迁移。

综上所述，该研究揭示了细胞外渗透压通过调节细胞骨架动力学、FAs 形成和细胞极性影响成骨细胞迁移的机制。细胞外渗透压变化通过影响细胞内压力，激活 TRPV4 通道，进而调节 Rho/ROCK 信号通路，最终影响成骨细胞迁移。这一研究成果为理解骨重塑过程提供了新的视角，也为治疗骨骼疾病如骨质疏松症等提供了潜在的治疗靶点。然而，研究也存在一定局限性，比如研究未涉及钙信号通路中其他关键蛋白如整合素（integrins）和 PIEZOs 对成骨细胞行为的影响。未来研究可进一步深入探索这些方面，以更全面地理解成骨细胞迁移和骨生物学的信号转导机制。