hnRNP A2/B1 剪接变体胞质积累：渐冻症（ALS）发病机制的新突破

《Cell Death & Disease》：Cytoplasmic accumulation of a splice variant of hnRNPA2/B1 contributes to FUS-associated toxicity in a mouse model of ALS

为探究 RNA 结合蛋白（RBPs）功能异常与肌萎缩侧索硬化症（ALS）发病机制的关系，研究人员开展了 FUS 与 hnRNP A2/B1 在 ALS 中作用的研究。结果发现 FUS 影响 hnRNP A2/B1 剪接，其缺失外显子 9 的变体在胞质积累，加剧疾病表型。该研究为 ALS 发病机制提供新见解。

　　在神经科学的神秘领域中，肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）一直是困扰科学界的难题。这是一种渐进性的神经退行性疾病，患者的运动神经元会逐渐退化，导致肌肉萎缩和无力，严重影响生活质量，甚至危及生命。目前，虽然科学家们知道 RNA 功能障碍在 ALS 的发病机制中起着关键作用，像 FUS、TDP - 43 等 RNA 结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）的异常定位与功能改变和疾病紧密相关，但对于其中具体的分子机制，仍有许多未知等待探索。

为了深入揭开 ALS 发病机制的神秘面纱，来自意大利的多个研究机构，包括罗马的转化药理学研究所（IFT - CNR）、罗马第二大学（University of Rome Tor Vergata）等的研究人员展开了一项重要研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上。

研究人员为了开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，选用表达人野生型 FUS（hFUS）的 Tg (Prnp - FUS) WT3Cshw/J 小鼠作为动物模型，通过对不同疾病阶段小鼠的研究，深入了解疾病进程中的变化。在细胞实验中，培养了 HeLa、SH - SY5Y 等多种细胞系，利用质粒转染、核酸提取与分析等技术，探究基因和蛋白的表达与功能变化。同时，采用免疫荧光分析、共聚焦显微镜等技术，直观观察蛋白的定位和细胞内的变化。

研究结果主要分为以下几个方面：

• hnRNP A2/B1 剪接异构体的变化：研究人员发现，在症状明显的 hFUS 小鼠脊髓中，hnRNP A2/B1 剪接异构体发生了显著变化。通过半定量 RT - PCR 和蛋白质免疫印迹分析可知，疾病末期（39 - 41 天）的 hFUS 小鼠脊髓中，缺少外显子 9 的 hnRNP A2/B1 异构体（A2b 和 B1b）表达明显增加，而包含外显子 9 的异构体（A2 和 B1）表达则下调。这种外显子 9 的跳跃现象与疾病症状的出现同步（31 - 36 天），并持续到疾病末期，且外显子 2 的可变剪接在疾病过程中保持不变。
• hnRNP A2b/B1b 的胞质积累：对非转基因和末期 hFUS 小鼠脊髓切片进行共聚焦免疫荧光分析显示，在正常小鼠的脊髓腹角，包含外显子 9 的 hnRNP A2/B1 异构体主要定位于细胞核；而在 hFUS 小鼠中，这些异构体的信号明显减弱，且缺少外显子 9 的 A2b/B1b 异构体在退化的运动神经元胞质中积累，在胞体中呈现为浓缩的颗粒状。此外，胶质细胞可能也参与了 hnRNP A2/B1 异构体表达的改变。
• 外显子 9 跳跃对蛋白定位的影响：在体外培养细胞实验中，转染 HA 标记的 hnRNP A2/B1 异构体构建体后发现，包含外显子 9 的异构体（A2 和 B1）主要定位于细胞核，而缺少外显子 9 的异构体（A2b 和 B1b）则在胞质和细胞核中均有分布，且部分 A2b 转染细胞的胞质中出现应激颗粒（SGs），说明缺少外显子 9 促进了 hnRNP A2/B1 的胞质定位。在小鼠原代皮质神经元实验中也得到了类似结果。
• 外显子 9 跳跃增加蛋白招募到 SGs：在应激条件下，如用亚砷酸钠（NaAs）处理细胞，A2b 异构体比 A2 异构体更易定位到 SGs 中，且这种趋势在处理早期（20 分钟）就很明显。B1b 异构体也有类似趋势，但程度较弱。核质分离实验进一步证实了这一结果，且发现 A2b 在胞质中的水平高于 A2。
• 胞质定位的作用：通过对蛋白溶解性和无序性分析发现，A2b 异构体定位到 SGs 的能力增强并非由其溶解性或无序性改变导致，而是与核质定位直接相关。实验表明，缺少 M9 - NLS（一种核定位信号）的 A2 变体（A2_ΔNLS）会定位于胞质并显著招募到 SGs 中，而强制定位于细胞核的 A2b 变体（A2b + NLS）则不会定位到 SGs 中。在神经元细胞中表达 A2b 和 A2 变体的实验显示，A2b 诱导了细胞凋亡，表现为活性 caspase 3 和 PARP1 裂解形式的表达增加，而 A2b + NLS 则不能诱导凋亡，说明胞质定位足以诱导细胞毒性。
• FUS 与 hnRNP A2/B1 的功能相互作用：通过对 FUS 缺失 / KO 小鼠和 hnRNP A2/B1 缺失小鼠数据集的比较分析，发现 FUS 和 hnRNP A2/B1 控制的剪接事件有显著重叠。生物信息学分析和 RT - PCR 验证表明，两者共同影响的基因剪接事件与 RNA 加工控制相关，支持了 FUS - hnRNP A2/B1 相互作用介导的剪接改变级联在 FUS 介导的 ALS 发病机制中的作用。
• 剪接转换寡核苷酸的影响：设计剪接转换寡核苷酸（SSOs）促进 hnRNP A2/B1 mRNA 外显子 9 跳跃，体内实验显示，在 hFUS 小鼠脑室内注射 SSO A 后，外显子 9 跳跃增强，A2b/B1b 蛋白表达增加，同时运动神经元损失加剧，脊髓小胶质细胞增生增强，FUS/hnRNP A2/B1 靶基因的可变剪接改变也更明显，表明 SSO A 加剧了 hFUS 小鼠的病理表型。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：在 ALS 小鼠模型中，FUS 诱导的 hnRNP A2/B1 剪接改变导致其核质分布异常，缺少外显子 9 的异构体在胞质积累，进而促进运动神经元变性。这一发现揭示了 ALS 发病机制中一个新的关键环节，为深入理解 ALS 的病理过程提供了重要依据，也为未来开发针对 ALS 的治疗策略提供了潜在的新靶点和方向，对推动 ALS 的研究和治疗具有重要意义。