揭秘十字花科五物种 14 - 3 - 3 基因家族：进化历程与功能奥秘

《BMC Genomics》：Genome-wide identification and comparative evolution of 14–3-3 gene family members in five Brassicaceae species

为解决十字花科物种 14 - 3 - 3 基因家族系统特征及进化关系未明确的问题，研究人员开展了对拟南芥（Arabidopsis thaliana）、琴叶拟南芥（A. lyrata）等五物种 14 - 3 - 3 基因家族的全基因组鉴定等研究。结果发现该家族成员数量与基因组大小并非直接相关等。这为研究其功能机制奠定基础。

　　在植物的生长发育过程中，14 - 3 - 3 蛋白作为一类高度保守的调节蛋白，如同精密仪器中的关键零件，在细胞生命活动以及植物应对各种环境变化时发挥着至关重要的作用。它们广泛存在于真核生物中，能够与众多靶蛋白相互作用，影响植物生长、发育和应激反应等多个方面。然而，对于十字花科植物而言，14 - 3 - 3 基因家族的系统特征以及它们之间的进化关系，却像一团迷雾，尚未被完全揭示。这一知识缺口限制了人们对十字花科植物生长发育机制的深入理解，也阻碍了相关农业应用的进一步发展。为了驱散这团迷雾，石河子大学以及安徽科技学院作物生物技术中心的研究人员决定深入探索，开展了一项针对十字花科五物种 14 - 3 - 3 基因家族的全面研究。
研究人员从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、琴叶拟南芥（A. lyrata）、小拟南芥（A. pumila）、亚麻荠（Camelina sativa）和甘蓝（Brassica oleracea）这五个十字花科物种入手，利用比较基因组学的方法，对 14 - 3 - 3 基因家族成员进行了全基因组鉴定、结构特征分析以及比较进化分析。他们的研究成果发表在《BMC Genomics》上，为该领域带来了新的曙光。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过从公共数据库下载基因组数据，结合实验室提供的数据，利用 BLASTP 搜索和结构域比对来鉴定 14 - 3 - 3 基因。接着，借助 DNAMAN、ClustalX 和 MEGA11 软件进行序列比对和系统发育分析。同时，利用 TBtools - II 软件、GSDS 和 MEME 网站进行基因结构和保守基序分析。此外，运用 MCScanX 方法、DnaSP 6.0 软件分析共线性和选择压力。还通过 RNA - seq 数据和 qRT - PCR 技术分析基因表达情况，并利用 AlphaFold 3 预测蛋白结构、进行亚细胞定位和遗传转化实验。
研究结果如下：

1. 14 - 3 - 3 基因家族成员的鉴定与比较进化：通过对五个物种全基因组序列的分析，研究人员共鉴定出 108 个 14 - 3 - 3 基因。其中，拟南芥和琴叶拟南芥的 14 - 3 - 3 基因数量最少，均为 13 个；亚麻荠的基因数量最多，达到 39 个。这些基因编码的蛋白质在氨基酸序列长度、分子量和等电点上存在差异，且均为酸性亲水蛋白。进化分析表明，14 - 3 - 3 蛋白可分为 ε 和非 ε 亚组，且非 ε 亚组的成员数量多于 ε 亚组。此外，不同物种间的同源基因数量存在差异，如 GRF3 的同源基因数量最多，而某些基因在部分物种中缺失。
2. 14 - 3 - 3 基因家族成员的基因结构和蛋白保守基序：基因结构分析显示，非 ε 组基因结构较为保守，通常由 4 个外显子和 3 个内含子组成；而 ε 组基因的外显子数量则在 6 - 9 个之间。通过 MEME 在线工具，研究人员鉴定出 10 个保守基序，所有成员都包含 motif3、6 和 7，motif8 和 motif10 分别只存在于非 ε 和 ε 亚组中。这些结构和基序的差异表明，14 - 3 - 3 基因家族在进化过程中经历了功能的保守和分化。
3. 14 - 3 - 3 基因成员的种间共线性：MCScanX 分析发现，共线基因仅分布在每个物种的部分染色体上，五个物种间共发现 92 对共线基因对。不同物种与拟南芥的共线基因对数量和分布存在差异，这表明 14 - 3 - 3 基因家族成员在进化过程中经历了扩张和收缩，且扩张更为明显。同时，进化选择压力分析表明，该基因家族在进化过程中受到了强烈的纯化选择，ε 组基因的纯化选择相对较弱。
4. 14 - 3 - 3 基因成员的种内共线性：种内共线性分析共鉴定出 127 对共线基因对，其中亚麻荠的共线基因对数量最多。大多数基因在进化过程中经历了纯化选择，只有 ApGRF13 - 2/ApGRF13 - 1 共线基因对的 Ka/Ks 值略大于 1，暗示其可能处于适应性进化过程。
5. 14 - 3 - 3 基因家族成员的复制历史：基因复制分析表明，14 - 3 - 3 基因主要以全基因组 / 片段复制（WGD/S）的形式存在，不同物种中 WGD/S 复制基因的频率有所不同。此外，还存在分散、近端和串联复制等其他复制方式。
6. 14 - 3 - 3 基因启动子中的顺式元件筛选：对 108 个 14 - 3 - 3 基因启动子的 2.0 kb 上游序列进行筛选，发现了 53 类顺式作用元件，包括光响应、生长发育、激素响应和非生物胁迫响应等相关元件。其中，光响应元件最为丰富，不同物种中顺式元件的富集模式存在差异，反映了该基因家族功能的多样性。
7. 小拟南芥 14 - 3 - 3 基因的组织特异性表达模式：利用 RNA - seq 数据生成的组织表达热图显示，小拟南芥 14 - 3 - 3 基因的表达模式可分为三个主要组。不同组的基因在不同组织中表现出特异性表达，如 C1 组的大多数成员在子叶和下胚轴中高表达，C2 组的基因在角果和花中高表达，C3 组的基因则在茎、根和花中特异性表达。qRT - PCR 分析进一步证实了部分基因的组织特异性表达，这表明不同的 Ap14 - 3 - 3 基因可能具有功能特异性。
8. 小拟南芥 Ap14 - 3 - 3 基因在 250 mM NaCl 胁迫下的表达模式：对小拟南芥在盐胁迫下的转录组数据进行分析，发现 Ap14 - 3 - 3 基因的表达谱呈现出三种主要模式。部分基因在盐胁迫下表达上调，部分基因表达下调，还有部分基因的表达先上调后下调。qRT - PCR 结果与 RNA - seq 数据基本一致，但也存在一些差异。这些结果表明，Ap14 - 3 - 3 基因在小拟南芥应对盐胁迫的过程中发挥着重要作用，且不同基因的作用方式可能不同。
9. GRF6 蛋白的三维结构预测和 ApGRF6 - 2 蛋白的亚细胞定位：利用 AlphaFold 3 对 GRF6 同源蛋白进行三维结构预测，发现不同物种的 GRF6 蛋白都包含 9 个 α - 螺旋结构，且 α3 和 α4 是最长的螺旋，这表明 GRF6 蛋白结构在不同物种间高度保守。通过将 35S:ApGRF6 - 2 - GFP 载体转化到拟南芥原生质体中进行荧光观察，发现 ApGRF6 - 2 蛋白定位于细胞质和细胞核中。
10. ApGRF6 - 2 基因的异位过表达促进拟南芥开花：研究人员构建了 35S:ApGRF6 - 2 转基因拟南芥植株，发现转基因植株比野生型植株开花更早，且开花时的莲座叶数量显著减少。qRT - PCR 证实转基因植株中 ApGRF6 - 2 基因的表达显著高于野生型植株，同时内源性开花基因 FRUITFULL（AtFUL）、APETALA1（AtAP1）和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（AtSOC1）的表达也上调。
    综合研究结果和讨论部分，这项研究全面系统地鉴定了十字花科五物种的 14 - 3 - 3 基因家族成员，揭示了它们在进化过程中的保守性和多样性。研究发现 14 - 3 - 3 基因家族成员的数量与植物基因组大小并非直接成比例，且该家族在不同物种中经历了不同程度的扩张和收缩。同时，基因结构、保守基序、共线性分析以及顺式作用元件的研究都为理解 14 - 3 - 3 基因的功能提供了重要线索。此外，小拟南芥 14 - 3 - 3 基因的组织特异性表达和对盐胁迫的响应，以及 ApGRF6 - 2 基因对开花的调控作用，都为进一步研究 14 - 3 - 3 基因在植物生长发育和环境适应中的功能机制奠定了坚实基础。这不仅有助于深入理解十字花科植物的生物学特性，也为未来利用这些基因改良作物性状、提高作物抗逆性和调控开花时间提供了理论依据和潜在的基因资源。