综述：利用工程酵母合成具有多种药理活性的植物源异黄酮及其前体的研究进展

《Microbial Cell Factories》：Advances in synthesizing plant-derived isoflavones and their precursors with multiple pharmacological activities using engineered yeasts

这篇综述聚焦植物源异黄酮及其前体，详细阐述了它们的药理活性、生物合成途径，以及利用工程酵母合成的技术策略。同时探讨了合成生物学在异黄酮绿色生产中的应用，为相关领域研究提供了全面且有价值的参考，值得一读。

　　### 引言
植物中的次生代谢物种类繁多，包括萜类、多酚、黄酮类、类固醇、生物碱、醌和多糖等。其中，黄酮类化合物广泛存在于多种植物中，而异黄酮作为黄酮类的一个亚类，已在超过 300 种植物的 2000 多个物种中被发现。

目前，获取异黄酮的主要方法是植物提取，但这种方法存在诸多问题。一方面，豆科植物中异黄酮等生物活性化合物含量较低，通常在 1‰ - 1% 之间；另一方面，植物生长周期长，易受季节、气候和地理因素影响，导致生产不稳定。化学合成异黄酮也面临挑战，其结构复杂，甲基化、羟基化和分子重排等复杂过程难以高效进行，且化学合成过程中使用的有机溶剂和试剂会带来环境问题。

合成生物学的发展为异黄酮的生产提供了新途径。它可利用植物多组学数据，在微生物细胞工厂中合成植物生物活性化合物，构建绿色、高效的产业链。本文将对异黄酮及其前体的药理活性、生物合成途径，以及工程酵母合成异黄酮的技术策略进行综述123。

异黄酮及其前体在植物中的药理活性

许多豆科植物，如甘草（Glycyrrhiza uralensis）、葛根（Pueraria lobata）、紫花苜蓿（Medicago sativa）和小花羽扇豆（Lupinus micranthus），在传统中医中被广泛用作草药。这些植物中的异黄酮属于苯丙素代谢子类，不仅能帮助植物抵抗生物和非生物胁迫，还具有多种生物活性45。

甘草是中国二级保护野生药用植物，其根和根茎中含有黄酮类和二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、保护胃黏膜和抗过敏等多种健康功效。葛根具有解酒、护肝、降血糖、降血脂、缓解绝经后骨质疏松、抗肿瘤、抗炎和抗氧化等作用。紫花苜蓿富含异黄酮、黄酮和多酚，具有抗菌、抗炎、抗氧化和促进伤口愈合等药理活性。小花羽扇豆富含异黄酮和皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和降血脂等多种药理作用6。

异黄酮生物合成的关键前体包括 p - 羟基肉桂酸（p-HCA），它可由 L - 苯丙氨酸（L - Phe）或 L - 酪氨酸（L - Tyr）衍生而来。p-HCA 是一种常见的膳食多酚，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗高血压、心血管保护和抑制黑色素生成等功能。由 p-HCA 产生的异甘草素，可通过诱导细胞凋亡和自噬，直接抑制多种恶性肿瘤，如宫颈癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌，还能有效治疗慢性阻塞性肺疾病等呼吸道感染79。

异甘草素经异构化生成的甘草素，是一种二氢黄酮类化合物，也是一种高选择性的植物源 β - 受体激动剂。甘草素及其衍生物具有抗炎、抗氧化和抗溃疡等作用，在多种肿瘤治疗中发挥积极作用。但甘草素口服生物利用度较低，需要进一步研究其生物合成机制，以提高生物利用度并拓展其应用810。

柚皮素是另一种异黄酮前体，属于二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗糖尿病和神经保护等多种医学特性，是功能性食品的重要成分810。

具有多样药理活性的异黄酮

异黄酮具有独特的C6??C3??C6?黄酮骨架，B 环连接在C3?位置。染料木黄酮（Genistein）和大豆苷元（Daidzein）是异黄酮的两种主要支架，通过对其结构修饰或变化，可产生多种具有独特药理活性的异黄酮衍生物11。

异黄酮可调节 NF - κB 信号通路，抑制 TNF - α、IL - 6 等炎症因子的表达，减少 NO 生成，抑制 cGMP 激活，激活 BKCa2+通道，从而发挥抗炎和镇痛作用。同时，异黄酮对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和某些真菌具有较强的抗菌活性，最低抑菌浓度均在 100.0 μg/L 以上，在抗菌领域具有潜在应用价值1213。

异黄酮的抗氧化性能优于维生素 C，具有很强的 DPPH 自由基清除能力，还能调节亚油酸过氧化和脂氧合酶活性，有助于预防自由基积累，降低多种疾病风险。例如，葛根异黄酮、大豆异黄酮、苜蓿异黄酮、甘草异黄酮和紫檀素等异黄酮，可通过改善氧化应激，增强大鼠心脏功能，在降低与银屑病等相关疾病风险方面具有重要治疗潜力14。

在癌症治疗方面，染料木黄酮可抑制 COX2 通路和 GLUT 受体表达，从而抑制前列腺癌细胞增殖；大豆苷元可干扰癌细胞增殖并诱导凋亡，对抗乳腺癌和子宫内膜癌等疾病；刺芒柄花素可抑制 c - Myc 基因靶点，减少乳腺癌细胞迁移和侵袭；葛根素可显著抑制人肺癌细胞生长，具有潜在的抗肺癌活性15。

异黄酮在心血管疾病治疗中也发挥着重要作用。葛根素可通过调节肠道菌群，尤其是抑制普雷沃氏菌（Prevotella copri）及其三甲胺的产生，用于治疗动脉粥样硬化；大豆苷元可降低绝经后妇女心血管疾病的发病率；苜蓿异黄酮可改善血脂水平，降低心脏病风险，促进血管舒张，增强血液循环15。

此外，刺芒柄花素在创伤性脑损伤、脊髓损伤、缺血性中风、神经肿瘤和阿尔茨海默病等疾病的治疗中显示出一定效果；鸢尾素可增强神经细胞的抗氧化能力，减轻氧化应激反应；葛根素和毛蕊异黄酮可减轻脊髓损伤大鼠的学习和记忆障碍，恢复神经功能，保护神经系统，但在异黄酮对中枢神经系统信号通路的影响方面，仍需进一步研究，为开发针对中枢神经系统的新药奠定理论基础16。

葛根素还具有广泛认可的抗糖尿病作用，可通过提高葡萄糖耐量和增加细胞对葡萄糖的摄取来降低血糖水平；大豆异黄酮在控制血糖和血脂水平方面发挥积极作用，可增强低密度脂蛋白（LDL）受体活性，降低 LDL 水平，防止 LDL 氧化，从而减少 LDL 在冠状动脉壁的沉积1617。

异黄酮还能抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素生成，如光甘草定是一种高端化妆品中常用的美白成分。同时，异黄酮在保护肝肾功能、调节骨代谢和改善肺水肿等方面也具有治疗活性，在医学和化妆品行业具有广阔的应用前景18。

利用工程酵母合成异黄酮

植物提取和化学合成方法的局限性导致异黄酮供应短缺。酵母因具有多种与异黄酮相关的内源性代谢途径，如甲羟戊酸（MVA）途径、糖酵解途径和莽草酸途径，且易于表达植物基因，成为异黄酮异源合成的理想宿主19。

要高效生产异黄酮，需挖掘异黄酮生物合成酶，设计高效的生物合成途径，并对酵母代谢进行优化和重新编程。

异黄酮及其前体的合成途径

异黄酮及其前体的生物合成途径涉及多个生化过程，包括中心碳代谢、莽草酸代谢、芳香族氨基酸（AAA）生物合成、MVA 代谢、黄酮类代谢和下游产物修饰20。

从头合成异黄酮始于糖酵解或磷酸戊糖途径（PPP），生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖 - 4 - 磷酸（E4P）。然后，在 3 - 脱氧 - D - 阿拉伯庚酮糖酸 - 7 - 磷酸（DAHP）合酶（ARO3 和 ARO4）的催化下形成 DAHP。DAHP 经莽草酸脱氢酶（ARO1）催化反应生成 5 - 烯醇丙酮酸莽草酸 - 3 - 磷酸（EPSP），EPSP 再经分支酸合酶（ARO2）和分支酸变位酶（ARO7）催化转化为分支酸（CHA），最终形成预苯酸（PPA）20。

在酵母中，PPA 可通过预苯酸脱水酶（PHA2）和芳香族氨基转移酶 I（ARO8）转化为 L - Phe；在大肠杆菌中，PPA 可同时转化为 L - Phe 和 L - Tyr。L - Phe 在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羟化酶（C4H）和细胞色素 P450 还原酶（CPR）的作用下可转化为 p - HCA；酪氨酸解氨酶（TAL）可催化 L - Tyr 合成 p - HCA。p - HCA 在 4 - 香豆酰 - CoA 连接酶（4CL）的催化下转化为 4 - 香豆酰 - CoA。

异甘草素由一分子 4 - 香豆酰 - CoA 和三分子丙二酰 - CoA 在查尔酮合酶（CHS）和查尔酮还原酶（CHR）的共同催化下合成，再经查尔酮异构酶（CHI）转化为甘草素。柚皮素则由 4 - 香豆酰 - CoA 和丙二酰 - CoA 通过 CHS 和 CHI 直接合成2122。

多种异黄酮，如大豆苷元和染料木黄酮，由异黄酮合酶（IFS）和 CPR 合成。在酵母中，大豆苷元由甘草素通过 2 - 羟基异黄酮合酶（2 - HIS）和 2 - 羟基异黄酮脱水酶（HID）的协同催化生成。这些异黄酮还可通过 UDP - 糖基转移酶（UGT）进一步合成大豆苷、染料木苷等。小麦中的生物活性异黄酮 5 - 羟基 - 2’，4’，7 - 三甲氧基异黄酮，可通过 CYP71F53 基因簇介导的柚皮素转化合成。以大豆苷元为底物，在异黄酮 2’ - 羟化酶（I2’H）和异戊烯基转移酶（G4DT 或 G2DT）的催化下，可进行 C - 4 或 C - 2 异戊烯基化，生成大豆抗毒素2324。

细胞色素 P450 酶或相关酶可催化以染料木黄酮为底物合成普瑞斯坦因（Pratensein）和樱黄素（Prunetin）等异黄酮。刺芒柄花素（Formononetin）和鹰嘴豆芽素 A（Biochanin A）可在异黄酮 4’ - O - 甲基转移酶（I4’OMT）的催化下由大豆苷元合成，在 UGT 的协助下进一步转化为葛根素。刺芒柄花素还可在异黄酮 3’ - 羟化酶（I3’H）的催化下合成毛蕊异黄酮（Calycosin），毛蕊异黄酮是合成 medicarpin 的前体，在 vestitone 还原酶（VR）和紫檀芪合酶（PTS）的协同作用下完成合成。二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）和 medicarpin 可能是合成 4’ - O - 甲基光甘草定的底物24。

工程酵母合成异黄酮的策略

在工程酵母中生产植物天然产物，需要系统地进行基因发现、酶表征、代谢工程和发酵优化25。

首先，发现参与异黄酮生物合成的关键酶并阐明其生物合成途径至关重要。可利用转录组数据与代谢组数据进行分析和比较，以识别潜在的异黄酮生物合成关键酶。同时，结合数据库中已知的异黄酮生物合成酶序列，以及各种基于组学的发现方法和计算工具，预测异黄酮生物合成的候选酶，并揭示其潜在代谢途径。通过整合代谢网络分析和基因家族进化策略，对 22 种黄芩属植物的研究鉴定出 261 种黄酮类化合物，并描绘出具有不同催化功能的 5 个 P450 亚家族 CYP82D 分支，揭示了细胞色素 P450 酶在植物代谢中的重要作用26。

确定关键酶后，在工程微生物中进行基因表达和酶学表征，以确认其在体内的催化作用。对甘草、大豆和葛根等豆科植物的新鲜组织样本进行代谢组和转录组测序，鉴定出 IFS、HIS 和 HID 等异黄酮合成的候选酶。利用结构生物学方法揭示异黄酮生物合成酶的分子结构和催化位点，通过构建蛋白质支架组装多酶系统，可实现从（2S） - 柚皮苷一步有效合成大豆苷元。借助酵母基因组代谢模型，设计和优化异黄酮生物合成途径，调节代谢通量，提高异黄酮合成效率2728。

在工程酵母中，过表达关键基因、增加异黄酮前体供应和敲除竞争途径基因，可增强异黄酮的代谢通量。例如，使用半乳糖诱导启动子过表达大豆苷元合成相关关键基因，可使酵母中大豆苷元合成效率提高 2 - 3 倍，通过添加葡萄糖和消除抑制性转录因子，产量进一步提高。在酵母中从甘草素合成 medicarpin 时，增加前体甘草素的可用性可提高 medicarpin 产量。此外，增加染料木黄酮生物合成基因的拷贝数，可使酵母中从头合成染料木黄酮的产量提高约 200 倍29。

工程酵母中异黄酮及其前体的合成

深入理解异黄酮及其前体的生物合成机制，是异源合成异黄酮的基础。在合成 p - HCA 时，E4P 通过糖酵解途径或 PPP 产生，是酵母合成 AAA 的有限底物。引入 PHK 途径，包括磷酸酮醇酶（Xfpk）和磷酸转乙酰酶（Pta），可使果糖 - 6 - 磷酸（F6P）直接转化为 E4P 和乙酰辅酶 A（Acetyl - CoA），提高 p - HCA 和丙二酰 - CoA 的产量。同时，过表达酵母内源性基因 ARO1、ARO2、ARO3、ARO4 和 ARO7 可增加 PPA 产量，但 ARO4、ARO7 和 ARO3 分别受 L - Tyr 和 L - Phe 的反馈抑制，通过引入突变产生酪氨酸不敏感等位基因ARO4K229L和ARO7G141S或过表达这些基因，可进一步提高 p - HCA 产量。过表达预苯酸脱氢酶和 ARO8 基因，可增加 L - Phe 和 L - Tyr 的代谢通量3031。

在从 L - Phe 和 L - Tyr 到 p - HCA 的异黄酮合成途径中，引入异源 TAL 和 PAL 可提高 p - HCA 产量。苯丙酮酸脱羧酶（ARO10）和丙酮酸脱羧酶（PDC5）可能使代谢通量转向其他代谢产物，编辑这两个基因可使更多代谢通量转向 L - Phe 和 L - Tyr，从而增加 p - HCA 合成。在酿酒酵母（S. cerevisiae）中，通过突变ARO4K229L和ARO7G141S并敲除 PDC5 和 ARO10 基因，p - HCA 产量可达 0.59 g/L 和 1.93 g/L，进一步优化后产量可达到 12.5 g/L。在解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）中，采用增加基因拷贝数、增强莽草酸途径通量和阻断苯丙氨酸竞争途径等策略，以纤维素或半纤维素为唯一碳源时，p - HCA 产量可达 84.3 ± 2.4 mg/L 和 65.3 ± 4.6 mg/L3233。

甘草素和柚皮素是多种异黄酮的关键前体，由一分子 4 - 香豆酰 - CoA 和三分子丙二酰 - CoA 合成。过表达基因 ACC1 或其突变体 ACC1S659A/S1157A，可增强乙酰辅酶 A 向丙二酰 - CoA 的转化；敲除酿酒酵母中的 YPL062W 基因可促进乙酰辅酶 A 积累，进而促进丙二酰 - CoA 合成；共表达 C4H 和 4CL 可显著促进 4 - 香豆酰 - CoA 的合成。甘草素的生物合成需要 CHS、CHR 和 CHI，CHS 和 CHI 对柚皮素的生产至关重要，提高 CHS 活性是增加柚皮素产量的关键34。

设计的甘草素合成途径，利用甘草中的 GuPAL1、GuC4H1、Gu4CL1、GuCHS1、GuCHR1 和 GuCHI1，导入酵母<