解析 ATP 柠檬酸裂解酶（ACL）、磷酸酮醇酶（PK）和苹果酸酶（cMAE）在油脂酵母 Rhodotorula toruloides 脂质合成中的关键作用

《Applied Microbiology and Biotechnology》：The role of ATP citrate lyase, phosphoketolase, and malic enzyme in oleaginous Rhodotorula toruloides

为明确磷酸酮醇酶（PK）、ATP 柠檬酸裂解酶（ACL）和胞质苹果酸酶（cMAE）在 Rhodotorula toruloides 脂质生物合成中的作用，研究人员运用 CRISPR/Cas9 技术敲除相关基因并在不同碳源下培养。结果表明 ACL 对脂质合成和细胞生长至关重要，PK 和 cMAE 作用不显著。该研究为 Rhodotorula toruloides 代谢工程提供依据。

　　在生物能源和生物基化学品领域，油脂微生物凭借利用廉价原料生产油脂的能力备受瞩目。其中，油脂酵母 Rhodotorula toruloides 因高脂质含量、强细胞活力和成熟的基因工程工具脱颖而出，成为极具潜力的细胞工厂。然而，其脂质合成的代谢机制却不像其他油脂真菌或酵母那般明晰，这限制了对其进一步的开发利用。为了深入探究 Rhodotorula toruloides 脂质合成的奥秘，来自塔林理工大学（Tallinn University of Technology）的研究人员开展了一项重要研究。

研究人员运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对 Rhodotorula toruloides IFO0880 菌株中的 PK、ACL 和 cMAE 基因进行靶向敲除，并在葡萄糖、木糖和乙酸作为唯一碳源的低氮矿物培养基中培养这些基因敲除菌株，通过测定细胞生长、脂质含量和脂肪酸组成等指标，分析这些基因在脂质合成中的作用。

研究结果如下：

1. ACL 基因敲除影响显著：在葡萄糖培养基中，ACL 基因敲除使脂质含量从野生型的 50% 降至 9%，最大比生长速率显著降低 41%；在木糖培养基中，脂质含量从 43% 降至 37.71%，虽然最终干重（DCW）有所增加，但比生长速率降低；在乙酸培养基中，脂质含量从 45% 降至 20%，生长严重延迟，最大比生长速率降低 40%。这表明 ACL 对 Rhodotorula toruloides 的脂肪酸合成和生长至关重要，碳源会影响细胞对 ACL 缺失的响应。
2. PK 基因敲除影响不大：在三种碳源培养基中，PK 基因敲除对菌株的生长和脂质合成均无明显影响，说明 PK 在野生型菌株的脂质合成中并非关键因素。
3. cMAE 基因敲除效果各异：在葡萄糖培养基中，cMAE 基因敲除使脂质含量增加 2.9%，比生长速率提高 23%；在木糖和乙酸培养基中，对生长和脂质合成无显著影响。这表明 cMAE 在 Rhodotorula toruloides 脂质合成中作用不显著，且在某些条件下可能不利于脂质合成。

研究结论和讨论部分指出，ACL 是 Rhodotorula toruloides 脂质合成和细胞生长的关键因素，其缺失导致脂质合成大幅减少和生长缺陷，且不同碳源下细胞的响应存在差异，暗示存在替代途径合成胞质乙酰辅酶 A。PK 对脂质合成并非不可或缺，可能受其他因素调控。cMAE 在脂质合成中作用不突出，细胞可通过其他途径再生 NADPH。

这项研究首次对 Rhodotorula toruloides 中 PK、ACL 和 cMAE 基因敲除进行系统研究，为深入理解该酵母脂质合成代谢机制提供重要依据，也为未来 Rhodotorula toruloides 的代谢工程改造奠定坚实基础，有助于优化其作为细胞工厂的性能，推动生物能源和生物基化学品的生产发展。

该研究主要运用了以下关键技术方法：

1. CRISPR/Cas9 基因编辑技术：设计针对 PK、ACL 和 cMAE 基因的向导 RNA（gRNA），构建表达 Cas9 和 gRNA 的质粒，通过锂乙酸 / 聚乙二醇（PEG）介导的化学转化法导入 Rhodotorula toruloides IFO0880 细胞，实现基因敲除。
2. 菌株培养与检测技术：在不同碳源的低氮矿物培养基中培养菌株，利用实时监测系统记录光密度（OD₆₀₀）、pH 和溶解氧等数据，计算比生长速率；采用气相色谱（GC）测定脂质含量和脂肪酸组成，使用高效液相色谱（HPLC）分析胞外代谢物。