重组犬过敏原 Can f 6 在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达优化及 IgE 反应性评估：助力宠物过敏精准诊疗

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Enhancing production and assessing IgE reactivity of dog allergen Can f 6 in Pichia pastoris and Escherichia coli

为解决宠物过敏诊断中天然来源过敏原提取物的局限性问题，研究人员开展了在毕赤酵母（Pichia pastoris）和大肠杆菌（Escherichia coli）中生产犬过敏原 Can f 6 并评估其 IgE 反应性的研究。结果表明融合麦芽糖结合蛋白（MBP）可提高产量，两种系统均适合生产，阳离子交换层析（CEX）纯化的蛋白 IgE 反应性更强。该研究为宠物过敏诊断提供了新方向。

　　宠物过敏在发达国家愈发普遍，像美国和欧洲，分别有 15.7% 和 27.2% 的人对猫和狗过敏，丹麦对狗过敏原的致敏率更是高达 56.0%。然而，即便过敏问题严峻，欧洲 25%、美国近 45.5% 的家庭仍养着狗。目前，过敏诊断和治疗主要依赖天然来源的过敏原提取物，但这些提取物存在诸多问题，比如成分复杂、质量不稳定等，难以满足精准医疗的需求。

为了突破这些困境，来自维尔纽斯大学生命科学中心生物技术研究所（Vilnius University, Life Sciences Center, Institute of Biotechnology）的研究人员进行了一项意义重大的研究。他们聚焦于犬过敏原 Can f 6，尝试在真核表达系统毕赤酵母中生产该蛋白，并与在大肠杆菌中生产的重组 Can f 6（rCan f 6）进行对比，评估其 IgE 抗原性。这一研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上，为宠物过敏的诊断和治疗开辟了新路径。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因工程技术，通过密码子优化合成 Can f 6 基因，并构建相应的表达载体。然后利用蛋白质纯化技术，从大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中纯化出目标蛋白。最后采用免疫分析技术，如免疫印迹（WB）和间接酶联免疫吸附测定（ELISA），来检测蛋白的纯度、稳定性和 IgE 反应性。研究使用的人血浆样本购自 PlasmaLab International。

研究结果如下：

• 大肠杆菌表达系统：将 Can f 6 基因分别导入 pET28-a (+) 和 pET28a ( +)-MBP-TEV 表达系统，成功表达出 rCan f 6 和 rMBP-Can f 6。经 SDS-PAGE 分析，可见对应蛋白条带，镍螯合层析后，rCan f 6 产量为 42mg/L，rMBP-Can f 6 产量达 78mg/L。WB 分析验证了蛋白身份，稳定性分析发现冻干会影响蛋白，-20°C 添加 40% 甘油保存稳定性较好。
• 毕赤酵母表达系统：利用 PichiaPink?表达系统，在毕赤酵母中成功表达 rCan f 6 和 rMBP-Can f 6。rCan f 6 经 Ni-NTA Superflow 柱纯化，产量为 36mg/L，SDS-PAGE 呈现双条带，分别为高糖基化和低糖基化形式。rMBP-Can f 6 采用阳离子交换（CEX）和阴离子交换（AEX）层析纯化，产量分别为 18.8mg/L 和 57.5mg/L，CEX 纯化的蛋白降解更明显。
• 免疫反应性：使用间接 ELISA 检测重组蛋白与患者血浆的免疫反应性，结果显示 rMBP-Can f 6 经 CEX 纯化后与 sIgE 的反应显著强于 AEX 纯化的蛋白。所有重组 Can f 6 变体均能特异性结合人血浆中的 Can f 6 sIgE，且无明显非特异性相互作用，糖基化对 IgE 反应性无显著影响。

研究结论和讨论部分指出，重组过敏原为过敏诊断带来新契机，能实现成分解析诊断（CRD），提升诊断准确性和治疗针对性。本研究首次在毕赤酵母中生产 Can f 6，发现融合 MBP 可提高产量，在大肠杆菌和毕赤酵母系统中均能有效生产该过敏原，N - 糖基化对其折叠和 sIgE 识别并非关键。综合考虑蛋白产量和对 sIgE 的反应性，大肠杆菌生产的 rMBP-Can f 6 更适合大规模生产。不过，该研究未进行嗜碱性粒细胞脱颗粒试验，未来还需进一步评估重组过敏原的体内变应原活性。总体而言，这项研究为宠物过敏的诊断和治疗提供了重要的理论依据和实践指导，推动了该领域的发展。