在无脊椎动物中发现铃蟾肽型神经肽信号系统及其功能特征：揭示进化起源与古老生理作用

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Discovery and functional characterization of a bombesin-type neuropeptide signaling system in an invertebrate

本文发现并鉴定了海星（Asterias rubens）中的铃蟾肽（BN）型神经肽信号系统。通过多种实验，确定了相关前体蛋白、受体，明确其分布及功能。该研究将 BN 型信号的进化追溯到棘皮动物和脊索动物的共同祖先，揭示其在调节摄食行为中的古老作用。

　　

引言

神经肽（Neuropeptides）作为进化上古老的信号分子，由神经元分泌，在动物体内参与调节多种生理和行为过程。其通常与 G 蛋白偶联受体（G protein–coupled receptors，GPCRs）结合发挥作用，许多神经肽 - 受体信号系统的进化起源可追溯到两侧对称动物的共同祖先。研究模式生物如果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）等，为神经肽信号系统进化研究提供了重要依据。近年来，对其他门类无脊椎动物的研究也愈发重要，如对海星（Asterias rubens）的研究，有助于深入了解促性腺激素释放激素 / 促心钠肽型、催乳素释放肽 / 短神经肽 F 型和生长抑素 / 咽侧体抑制素 C 型信号系统的进化。

铃蟾肽（BN; pQQRLGNQWAVGHLM-NH₂）最早从蟾蜍（Bombina bombina）皮肤中分离得到，随后在其他蛙类中发现了如蛙皮降压肽（ranatensin）和叶泡蛙肽（phyllolitorin）等相关肽，它们在 C 末端区域具有序列相似性。在哺乳动物中，还鉴定出了胃泌素释放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）和神经介素 B（neuromedin B，NMB）等 BN 相关肽。BN 型神经肽通过与 GPCRs 结合发挥作用，在哺乳动物和脊椎动物中参与调节胃肠道激素释放、平滑肌收缩、食物摄入抑制、饱腹感调节、昼夜节律调节以及学习和恐惧记忆增强等多种生理和行为过程。通过对基因组序列数据的系统发育分析，发现 BN 型神经肽信号的进化可追溯到脊索动物的共同祖先，但此前在非脊索动物中尚未发现 BN 型神经肽。本研究旨在探究非脊索动物棘皮动物中 BN 型神经肽信号的存在情况。

结果

1. 鉴定与脊索动物 BN 型肽序列相似的神经肽前体：通过分析转录组 / 基因组序列数据，在海星（A. rubens）和其他棘皮动物中鉴定出与脊索动物 BN 型肽序列相似的假定神经肽前体蛋白。这些前体蛋白中的假定神经肽序列与脊索动物 BN 型肽存在相似性，如部分棘皮动物肽的 N 末端 PRXN 基序和刺参（Apostichopus japonicus）肽的 C 末端 GXLMa 基序，以及海星肽中预测的酰胺化酪氨酸（Ya），这些特征与一些脊索动物 BN 型肽相同。序列比对还揭示了假定 BN 型神经肽的保守 N 末端 PRXN 基序和 C 末端 RIFGPXXa 基序，暗示棘皮动物中鉴定出的假定神经肽前体是脊索动物 BN 型肽前体的直系同源物，但还需进一步验证。
2. 系统发育分析：运用基于最大似然法的系统发育分析，研究棘皮动物中假定 BN 型前体与脊索动物 BN 型前体的关系。分析纳入了与 BN 型受体密切相关的肽的前体，包括脊椎动物的内皮素（ET）型肽前体、蜕皮动物原口动物的 CCH 酰胺（CCHa）型肽前体和冠轮动物原口动物的 CCHa 样兴奋性肽（EPs）前体，并以 Elevenin 型前体为外群。结果显示，海星（A. rubens）和其他棘皮动物的 BN 型前体与脊索动物 BN 型前体位于同一进化枝，进一步证明了棘皮动物中假定 BN 型前体与脊索动物 BN 型前体的直系同源关系。
3. 基因结构相似性：比较棘皮动物和脊索动物中编码假定 BN 型前体的基因的外显子 / 内含子结构。脊索动物 BN 型前体基因通常有两个内含子中断蛋白质编码序列，第一个为相位 1 内含子，中断 BN 型肽的编码序列，第二个为相位 0 内含子，中断前体蛋白 C 末端区域的编码序列。棘皮动物中编码假定 BN 型神经肽前体的基因都有三个内含子中断蛋白质编码序列，且第一个和第三个内含子的位置和相位与脊索动物 BN 型前体基因一致，其中第一个内含子（相位 1）中断假定神经肽的编码序列，这一特征在两者中相同。不过，棘皮动物假定 BN 型前体基因中的第二个内含子（相位 0）是该门类特有的，表明其在棘皮动物和脊索动物从共同祖先分化后产生。这些基因结构的相似性为两者的直系同源关系提供了有力证据。
4. 鉴定海星中源自 BN 型前体的肽：已获得证据表明海星（A. rubens）中的假定 BN 型前体（ArBNP; GenBank 登录号 XM_033768834.1）是脊索动物 BN 型前体的直系同源物，通过克隆和测序编码该蛋白的 cDNA，证实了从转录组 / 基因组序列数据分析得到的序列。ArBNP 是一种 102 个氨基酸残基的蛋白质，包含一个预测的 21 个氨基酸残基的 N 末端信号肽，基于其序列分析，可能衍生出三种潜在神经肽：C 末端酰胺化的 14 个氨基酸肽（ArBN，EPRRNYNRVFGPTY-NH₂）、C 末端酰胺化的 10 个氨基酸肽（ArBN_{5 - 14}; NYNRVFGPTY-NH₂）和 C 末端酰胺化的 16 个氨基酸肽（ArBNP_{65 - 81}; EPMPSSLALYIANLSP-NH₂）。合成这些参考肽后，对海星放射神经索提取物进行质谱分析，发现其中存在 ArBN 和 ArBN_{5 - 14}，但未检测到 ArBNP_{65 - 81}。
5. 鉴定海星中的 BN 型受体：在鉴定出海星（A. rubens）中天然衍生自 ArBNP 的 ArBN 和 ArBN_{5 - 14}后，通过对转录组 / 基因组数据的 BLAST 分析，鉴定出 11 个候选 BN 型受体（ArBNR1 - 11），在其他棘皮动物中也发现了这些蛋白的同源物。除 ArBNR2 外，其他候选受体都有七个预测的跨膜结构域，符合 GPCRs 的特征。对 ArBNR2 序列分析发现，其 272 位的谷氨酸残基在同属海星的Marthasterias glacialis的同源受体 MgBNR2 中为甘氨酸，将 ArBNR2 的谷氨酸替换为甘氨酸后（ArBNR2 (G₂₇₂)），也具有七个预测的跨膜结构域。通过 CLANS 分析 ArBNR1 - 11 与其他分类群的 BN 型受体及相关 GPCRs 的关系，发现 ArBNR1 - 9 位于包含 BN 型、ET 型和 CCHa/EP 型受体的簇中，ArBNR10 和 ArBNR11 则更远离该簇。系统发育分析表明，ArBNR1 - 11 及其他棘皮动物的相关受体与脊索动物 BN 型受体、脊索动物 ET 型受体和原口动物 CCHa/EP 型受体位于不同进化枝，但 ArBNR1 所在分支较短。进一步分析发现，ArBNR1 和其他棘皮动物的直系同源受体与脊索动物 BN 型受体以及半索动物Saccoglossus kowalevskii的假定 BN 型受体位于同一进化枝，而其他候选 BN 型受体则位于不同进化枝，这表明 ArBNR1 是海星中 BN 型肽 ArBN 和 / 或 ArBN_{5 - 14}的最强候选受体。
6. ArBN 作为 ArBNR1 的配体：确定 ArBNR1 为最强候选受体后，进行体外实验验证。结果发现，ArBN 能在转染 ArBNR1 和嵌合 G 蛋白 Gqs5 的中国仓鼠卵巢（CHO） - K1 细胞中引起剂量依赖性发光，半数最大反应浓度（EC₅₀）为 1.69 × 10^?11 M。而 ArBN_{5 - 14}和 ArBNP_{65 - 81}作为配体测试时，ArBN_{5 - 14}仅在最高测试浓度（10^?5 M）下引起微弱发光，且与溶解肽的培养基对照组差异不大，ArBNP_{65 - 81}则未引起发光，ArBN、ArBN_{5 - 14}和 ArBNP_{65 - 81}在表达其他测试受体（ArBNR2、ArBNR2 (G₂₇₂) 或 ArBNR3）的细胞以及转染空 pcDNA3.1 (+) 载体的细胞中均未触发发光，证实了 ArBNR1 是 ArBN 在海星中的受体。
7. ArBNP 转录本的表达分布：鉴定出海星中由 ArBN 和其同源受体 ArBNR1 组成的 BN 型信号系统后，利用 mRNA 原位杂交技术研究 ArBNP 转录本在海星中的表达。结果显示，ArBNP 在海星的神经系统、运动系统和消化系统中均有表达。在神经系统中，中央神经系统包括沿五条手臂口侧延伸的放射神经索和中央盘的围口神经环，放射神经索的神经外区域和神经下区域都有 ArBNP 表达细胞，但神经下区域更为丰富；围口神经环中，神经外区域的表达细胞较多，神经下区域也有部分表达。在运动系统的管足中，ArBNP 在管足的亚上皮层、基部神经环和盘区域均有表达。在消化系统中，ArBNP 在心脏胃和幽门胃中均有表达。
8. ArBNP 的免疫组化定位：尝试制备针对 ArBN 和 / 或 ArBNP 的抗血清以通过免疫组化方法观察其表达。最初用包含 ArBN 酰胺化 C 末端十肽的抗原肽 KNYNRVFGPTY-NH₂制备抗 ArBN 抗血清，但 ELISA 分析显示抗体效价低，在海星手臂切片上未观察到特异性免疫染色。随后，制备针对 ArBNP C 末端区域肽（KLAMTRMNSEAENE）的抗血清，ELISA 检测到抗血清中存在针对 ArBNP 抗原的抗体，经亲和纯化后用于免疫组化分析。结果显示，在放射神经索的神经外和神经下区域均有 ArBNP 免疫反应性（ArBNP - ir）细胞，神经外区域的神经毡中有密集的免疫染色纤维；围口神经环的神经外区域有明显的免疫染色细胞簇，神经下区域较少；在放射神经索的节段性侧支和边缘神经索中也有免疫染色细胞和 / 或突起；管足的亚上皮神经丛和基部神经环有免疫染色；在手臂尖端的感觉器官如终端触手、视神经垫和侧叶中也有 ArBNP - ir 细胞和免疫反应性神经丛；在体壁的一些附属物如叉棘和皮鳃中也观察到免疫染色；在消化系统的多个区域，如口膜、食道、心脏胃、幽门胃和幽门管的黏膜和基底上皮神经丛中均有 ArBNP - ir 细胞和 / 或纤维。
9. ArBN 对心脏胃和管足的作用：基于 ArBNP 在海星心脏胃和管足中的表达，研究 ArBN 对这些器官体外制备物的影响。结果表明，ArBN 在 10^?9至 10^?6 M 浓度范围内可引起心脏胃和管足制备物的剂量依赖性收缩。与引起心脏胃体外收缩的 NGFFYamide 相比，ArBN 在最高测试浓度（10^?6 M）下，引起的收缩幅度为 10^?7 M NGFFYamide 诱导收缩幅度（定义为 100% 收缩）的 36.48 ± 6.02%（n = 10），在 10^?7 M 时达到最大功效，为 10^?7 M NGFFYamide 诱导收缩幅度的 52.48 ± 6.19%（n = 10）。与引起管足体外收缩的乙酰胆碱（ACh）相比，ArBN 在最高测试浓度（10^?6 M）下，引起的收缩幅度为 10^?5 M ACh 诱导收缩幅度（定义为 100% 收缩）的 303.50 ± 27.16%（n = 10）。测试 ArBN_{5 - 14}和 ArBNP_{65 - 81}对已对 ArBN 有反应的心脏胃和管足制备物的影响，发现二者均无明显作用。
10. ArBN 对心脏胃回缩的体内作用：海星（A. rubens）进食时会将心脏胃从口中翻出覆盖在猎物可消化的软组织上，进食完成后胃会回缩。此前研究表明 NGFFYamide 可在体外触发心脏胃收缩，在体内引起心脏胃回缩。由于 ArBN 在体外可引起心脏胃收缩，因此研究其在体内对心脏胃回缩的影响。通过向浸泡在 2% MgCl₂海水中诱导心脏胃外翻的海星注射 ArBN，发现注射 10 μL 10^?4 M ArBN 可引起心脏胃回缩，注射 6 分钟后外翻心脏胃的二维面积平均为注射前的 57.30 ± 6.00%，但效果比 NGFFYamide 弱，这与二者在体外诱导心脏胃收缩的相对功效一致。
11. ArBN 对摄食行为的影响：此前研究发现一些在体内引起心脏胃回缩的神经肽也会抑制海星的摄食行为。由于 ArBN 能触发海星心脏胃回缩，因此研究其对摄食行为的影响。将饥饿 30 天的海星和贻贝分别放置在水箱两端，比较注射 ArBN（10 μL 10^?4 M）和注射水的对照组海星的行为。结果显示，两组海星在接近和接触贻贝的比例以及进食贻贝的比例上没有显著差异，在接近和接触贻贝的时间上也没有显著差异，但在成功进食的海星中，注射 ArBN 的海星包围贻贝的时间显著长于注射水的海星，表明 ArBN 对海星的摄食行为有抑制作用。

讨论

1. 棘皮动物中 BN 型神经肽信号系统的发现：通过转录组 / 基因组序列数据分析，在棘皮动物中鉴定出假定的 BN 型肽前体，其预测肽序列与脊索动物 BN 型肽相似。系统发育分析和基因结构比较进一步证实了棘皮动物中假定 BN 型前体与脊索动物 BN 型前体的直系同源关系。在海星（A. rubens）中，利用质谱确定了源自 BN 型前体的成熟神经肽 ArBN 和 ArBN_{5 - 14}，并通过转录组 / 基因组序列数据分析和系统发育分析鉴定出 ArBN 的受体 ArBNR1。ArBN 对 ArBNR1 具有较高亲和力（EC₅₀ = 1.69 × 10^?11 M），而 ArBN_{5 - 14}仅在高浓度下才对表达 ArBNR1 的细胞有微弱反应。在其他棘皮动物中也鉴定出了 ArBN 型肽前体和 ArBNR1 的同源物，表明 BN 型信号在非脊索动物中存在，其进化历史可追溯到后口动物的共同祖先。
2. 海星中 BN 型神经肽 ArBN 的功能特征：在海星（A. rubens）中，ArBNP 在神经系统、运动系统和消化系统广泛表达。在神经系统中，其在神经外和神经下区域的神经元中均有表达，推测 ArBN 可能参与运动神经元对周围器官 / 肌肉的控制以及整合感觉输入协调动物整体行为。在管足中，ArBNP 的表达与管足的运动和摄食功能相关，ArBN 可引起管足剂量依赖性收缩，且比 ACh 更有效，此外，ArBNP 在管足盘区域的表达可能与调节粘附或脱粘物质的分泌有关。在消化系统中，ArBNP 在多个区域表达，ArBN 可引起心脏胃剂量依赖性收缩，在体内可触发心脏胃回缩，且对摄食行为有抑制作用，不过其抑制摄食行为的机制可能与影响管足和心脏胃的收缩，或对中枢神经系统的作用从而影响动物整体行为协调有关。
3. BN 型神经肽信号的进化与比较生理学：在海星（A. rubens）中发现 ArBN 及其受体 ArBNR1，揭示了 BN 型信号