揭秘海洋中降解聚羟基丁酸酯（PHB）细菌的基因组奥秘：为生物可降解塑料研究开辟新方向

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Draft genome sequences of six bacterial strains degrading the biodegradable plastic polyhydroxybutyrate (PHB)

为探究生物可降解塑料聚羟基丁酸酯（PHB）的降解机制，研究人员从日本沿海海水样本中分离出 6 株降解 PHB 的细菌并测序其基因组。结果显示，这些菌株基因组大小在 4.5 - 6.6 Mb，且与已知 PHB 降解菌在系统发育上不同，这为深入研究 PHB 降解机制及海洋生态作用提供了基础。

　　聚羟基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate，PHB）作为生物可降解塑料的原料，从环保角度来看，正被视作石油基塑料的替代品进行研究。到目前为止，在各种环境中都发现了能够降解 PHB 的细菌。不过，基于非培养的宏基因组分析表明，还有许多未被培养的 PHB 降解细菌存在。

在这项研究里，研究人员以海水为来源，从生物降解性测试样本中分离出了 PHB 降解细菌，并对它们的基因组进行测序。海水采集自日本沿海地区的海面（北纬 34°37′03.2″ ，东经 135°25′42.1″）。随后，在测试瓶中加入 30 毫克 PHB 粉末（德国默克公司产品）和 200 毫升海水，不添加任何营养源，在 27°C 搅拌条件下进行培养。通过实验室规模的生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand，BOD）测试仪（日本 TAITEC 公司的 BOD200F、德国 WTW 公司的 OxiTop IDS）测定氧气（O₂）消耗情况，以此评估 PHB 的降解程度。接下来，将培养物涂布在双层琼脂平板上，底层含有日本盐谷公司的人工海水 DAIGO 和酵母提取物或海洋琼脂，上层含有 1.2% 的 PHB 细粉。在 25°C 培养 2 周后，挑选出形成透明圈（表明具有 PHB 降解活性）的菌落，分离过程重复三次以进行纯化。用于基因组分析的细胞，是通过对液体培养样本进行离心、收集沉淀，或者从在含有酵母提取物的 DAIGO 培养基中、25°C 培养的琼脂平板上收集菌落获得的。

基因组 DNA 的提取使用德国 Macherey-Nagel 公司的 NucleoSpin Microbial DNA 试剂盒，按照试剂盒说明书操作。全基因组鸟枪法测序由中国北京的诺禾致源公司，利用美国 Illumina 公司的 NovaSeq6000 平台完成。使用美国 Covaris 公司的超声破碎系统对 DNA 进行片段化处理，结合美国 New England Biolabs 公司的 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina 试剂盒制备短读长文库。采用 Illumina 的 NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit v1.5 试剂套装，测定出 2×150 bp 的 Illumina 双端序列。运用 Fastp v0.23.1 软件进行测序读长质量控制和接头修剪。使用 SPAdes v3.15.3 软件进行基因组组装。利用日本 DNA 数据库（DNA Data Bank of Japan，DDBJ）的快速注释与提交工具（DDBJ Fast Annotation and Submission Tool，DFAST）1.2.20 版本流程对基因组进行结构注释，该流程包含多个程序：用 GAPannotator 1.0 版本处理组装缺口；MetaGeneAnnotator 2008/08/19 版本预测编码序列（Coding Sequence，CDS）；CRT 1.2 版本识别规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）；Aragorn 1.2.38 版本查找转运核糖核酸（Transfer RNA，tRNA）；Barrnap 0.8 版本预测核糖体核糖核酸（Ribosomal RNA，rRNA）。除特殊说明外，所有软件均采用默认参数。

这 6 个菌株的基因组长度在 4.49 - 6.65 Mbp 之间，GC 含量在 42.3% - 59.0% 范围内。基于平均核苷酸同一性（Average Nucleotide Identity，ANI）的系统发育分析（由 DFAST_QC 0.5.7 版本流程计算）表明，有 4 个菌株与席藻杆菌属（Sessilibacter）密切相关，另外 2 个菌株分别与玫瑰杆菌属（Roseibium）关系密切，ANI 值分别为 78% 和 88% 。在这 6 个菌株的基因组中均注释到了 PHB 解聚酶基因 [EC 3.1.1.75]。由于此前尚未有属于这两个属的 PHB 降解菌株的报道，因此需要进一步研究，以阐明它们在海洋生态系统中的 PHB 降解机制和生态作用。

本研究得到了新能源和工业技术开发组织（New Energy and Industrial Technology Development Organization，NEDO）委托的 “海洋生物降解评估方法开发” 项目（项目编号：20008）的支持。