揭示两种从角苔分离的蓝藻菌株基因组序列：开启共生蓝藻比较基因组学研究新篇章

为探究角苔与蓝藻的共生关系，来自多机构的研究人员开展了对从角苔物种 Notothylas orbicularis 和 Phaeoceros carolinianus 分离的共生蓝藻基因组研究。他们成功组装出两种蓝藻菌株的完整基因组，这将助力未来共生蓝藻的比较基因组学研究。

　　角苔（hornworts）与蓝藻（cyanobacteria）形成了共生关系，借此获取生物可利用的氮。研究宿主与蓝藻共生体之间的相互作用，对农业工程意义重大。尽管已识别出众多蓝藻共生体，但对其进行全基因组测序的却寥寥无几。在本研究中，研究人员从角苔中分离出两种蓝藻菌株 —— 从 Notothylas orbicularis 分离出的 “C110” 和从 Phaeoceros carolinianus 分离出的 “C117”，它们均采集自纽约州北部。首先，从叶状体上切下蓝藻共生体菌落，用 5% 的漂白剂进行消毒处理，然后将其放置在 BG11 平板上，在光照强度为 6 - 25 μmol m^?2 s^?1、光暗周期为 16/8 小时、温度为 22°C 的条件下培养。为获得纯培养物，单个菌落至少要进行两次划线分离。之后，将蓝藻在相同条件下的液体 BG11 培养基中培养，并持续振荡。通过估算叶绿素 a（chlorophyll-a）浓度来测定细胞密度。经离心，收获了 250 μg 的 C110 和 65 μg 的 C117 总叶绿素 a。利用 Wizard HMW DNA 提取试剂盒（Promega）分离基因组 DNA，并使用 Qubit 1X 双链 DNA（dsDNA）高灵敏度试剂盒在 Qubit 4 荧光计（Invitrogen）上进行定量。取 200 ng DNA，使用快速测序试剂盒 V14（SQK - RAD114，牛津纳米孔技术公司，英国）进行文库制备，且不进行任何大小筛选。通过小心操作尽量减少 DNA 片段的剪切，将其加载到 MinION R10.4.1 流动细胞（牛津纳米孔技术公司，英国）上进行 24 小时的测序。
在所有软件处理过程中，除非另有说明，均采用默认设置。原始数据使用 Dorado v0.7.3 以超高精度模式和双链碱基识别（duplex basecalling）进行碱基识别。合并双链和单链读数，C110 从 160,803 条读数中生成总计 879,153,448 个碱基（N50：71,877 bp），C117 从 201,384 条读数中生成总计 1,784,282,371 个碱基（N50：18,452 bp）。根据长度和质量标准对读数进行筛选，C110 的最小长度截断值为 1 k，最小质量截断值为 Q6；C117 的最小长度截断值为 30 k，最小质量截断值为 Q20。使用 Flye v2.9.2 进行基因组组装，当识别到足够的重叠区域时，该软件会将重叠群（contigs）环化。
C110 的组装结果产生了 11 个环形重叠群和 1 个线性重叠群，总长度为 8,366,001 bp（GC 含量为 41.42%）。最大的环形重叠群为 7,174,855 bp，其他重叠群长度在 32,854 bp 至 331,577 bp 之间。C117 的组装结果产生了 4 个环形和 2 个线性重叠群，总长度为 8,449,107 bp（GC 含量为 39.7%）。最大的环形重叠群为 7,883,191 bp，其他重叠群长度在 86,831 bp 至 280,883 bp 之间。这两个基因组的大小均在典型蓝藻的预期范围内。使用 Compleasm v0.2.6 分析两个基因组的完整性，C110 和 C117 的得分分别为 99.69% 和 99.16%。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的 PGAP v6.8 对基因组进行注释。将 C110 的 16S rRNA 序列与 GenBank 的核心核苷酸数据库进行比对，发现其与 Nostoc sp. ATCC 53789（GenBank CP046703.1）的同一性为 99.60%，使用 FastANI v1.33 进行平均核苷酸同一性（ANI）分析，得分达到 96.98%。C117 的 16S rRNA 序列与 Cylindrospermum sp. NIES - 4074（GenBank AP018269.1）的同一性为 97.24%，FastANI 得分 79.57%。
这项工作源自 2024 年在海洋生物实验室开展的分子与细胞生物学共生课程中的一个团队项目，由戈登和贝蒂?摩尔基金会资助，由卡内基科学研究所的菲利普?克莱夫斯和丹佛大学的斯科特?尼科尔斯组织。此外，这项工作还部分得到了美国国家科学基金会（NSF）授予 F. - W. L. 的 DEB - 1831428 和 DEB - 2426285 两项资助。