揭秘弓形虫关键激酶 TgGSK：调控虫体分裂与发育的潜在治疗靶点

《mSphere 3.7》：The essential kinase TgGSK regulates centrosome segregation and endodyogeny in Toxoplasma gondii

本文聚焦弓形虫（Toxoplasma gondii）的激酶 TgGSK 展开研究。发现 TgGSK 在虫体分裂过程中定位动态变化，对其存活与正常分裂至关重要。通过多组学分析揭示其参与多种关键过程，还与 GCN5b 相互作用。该研究为抗弓形虫药物研发提供新靶点，意义重大。

　　

引言

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛存在的寄生虫，能使免疫抑制、免疫受损以及先天性感染人群患病 。其高复制率是引发诸多严重后果的重要原因，弓形虫通过内二芽殖（endodyogeny）方式进行分裂。在此过程中，两个子代寄生虫在母细胞内逐渐形成，内膜复合体（IMC）、亚 pellicle 微管、中心体等结构发挥着重要作用。虽然内二芽殖的步骤已较为明确，但调控这一过程的信号和蛋白质尚未完全明晰。

研究团队之前对植物样磷酸酶 PPKL 进行了表征，它在弓形虫子代细胞形成中起调节作用，对寄生虫繁殖至关重要。在探寻弓形虫中植物油菜素内酯（brassinosteroid）信号通路其他成员时，发现了 TGGT1_265330，即丝氨酸 / 苏氨酸激酶 TgGSK，它属于糖原合酶激酶 3β 亚家族（GSK3）。此前虽有研究表明重组的 TgGSK 具有激酶活性且能自磷酸化，但对其在弓形虫中的定位和功能缺乏深入探究。本研究着重对 TgGSK 展开研究，旨在揭示其在弓形虫中的重要作用，为后续抗弓形虫治疗提供潜在靶点。

结果

1. 弓形虫 GSK 与植物激酶相关：TgGSK 由 TGGT1_265300 编码，是含 394 个氨基酸的丝氨酸 / 苏氨酸真核蛋白激酶（ePK），具有 12 个高度保守基序。它属于 GSK 亚家族，其 ATP 结合位点、配体结合位点和催化结构域的特征序列基序在所有 GSK 中都保守。通过 Clustal Omega 比对发现，TgGSK 与疟原虫（Plasmodium）的 GSK 和其他原生动物的 GSK 聚为一类，且与植物激酶（如拟南芥 BIN2）的亲缘关系比与动物、真菌的 GSK 更近。
2. TgGSK 的定位随细胞周期动态变化：利用 CRISPR/Cas9 技术构建了内源性蛋白带有三重血凝素标签（GSK.3xHA）的菌株。免疫荧光分析（IFA）显示，在非分裂寄生虫中，TgGSK 主要位于细胞核；而在分裂寄生虫中，它似乎遍布整个细胞。超微结构扩展显微镜（UExM）进一步发现，TgGSK 在细胞质中定位于微管蛋白集中区域，即中心体，且在寄生虫的基端和顶端都有分布，基端浓度更高。与中心蛋白 1 共染色证实，在非分裂和分裂寄生虫中，TgGSK 都集中在中心体周围。
3. TgGSK 对寄生虫生存至关重要：在弓形虫全基因组 CRISPR 筛选中，TgGSK 的适应度值为 -4.12，表明其具有重要性。研究人员构建了条件突变株，用四环素调控启动子（TATi）替换 TgGSK 的启动子。结果显示，经四环素类似物 aTC 处理后，TgGSK 的表达显著降低，处理 72 小时后几乎检测不到蛋白。并且，在 aTC 存在的情况下，TATi-GSK.3xHA 寄生虫无法繁殖形成噬斑，充分证实了 TgGSK 对寄生虫生存的必要性。
4. 敲低 TgGSK 导致异常分裂表型：对 TATi-GSK.3xHA 菌株在有无 aTC 的情况下进行 IFA 分析。结果发现，经 42 小时 aTC 处理后，尽管仍有部分残留的 TgGSK，但已出现明显的分裂缺陷，如分裂不同步、核分离不完全、寄生虫形态异常等。处理 96 小时后，这些表型更加明显，还出现了微管组织紊乱、核染色质凝聚异常等问题。
5. TgGSK 敲低导致中心体异常：由于在中心体检测到 TgGSK，且敲低 TgGSK 的寄生虫存在核分离缺陷，因此对突变寄生虫的中心体进行监测。IFA 结果显示，使用中心蛋白 1 和有丝分裂纺锤体标记物 EB1 染色后，发现中心体形态异常，包括中心体拉长和不完全分裂。通过 ImageJ 量化分析发现，aTC 处理的寄生虫每个细胞核的平均中心体数量显著低于未处理的寄生虫，部分液泡出现单个或无中心体但有多个细胞核的情况。UExM 进一步证实了这些异常表型。
6. 敲低 TGGSK 影响顶质体分裂：中心体除了协调细胞核的分离，还参与顶质体等细胞器的分离。研究发现，在敲低 TgGSK 的寄生虫中，顶质体的分裂和分离也受到影响。未经 aTC 处理的寄生虫每个细胞核平均约有一个顶质体，而经 aTC 处理的寄生虫每四个细胞核才有一个顶质体。对早期时间点的分析表明，顶质体分布缺陷可能先于中心体异常出现，或者二者在机制上相互独立。
7. 中心体、基端和剪接相关蛋白存在 TgGSK 依赖的磷酸化：进行全局磷酸化蛋白质组分析，发现敲低 TgGSK 后，有 27 种蛋白质的磷酸化水平降低，40 种蛋白质的磷酸化水平升高。通路分析显示，磷酸化水平降低的蛋白质中，有 3 种是 RNA 结合或剪接蛋白，3 种属于 MyoC 滑行体复合物；而磷酸化水平升高最明显的是中心蛋白 2。这表明 TgGSK 可能影响与中心体、基端复合物和剪接相关蛋白的调控。
8. TgGSK 与 GCN5b 复合物相互作用并受其调控：通过免疫沉淀结合质谱分析，发现与 TgGSK 相互作用的蛋白中，前 9 个中有 8 个是核蛋白，且均为 GCN5b 复合物成员。用乙酰转移酶抑制剂藤黄酸（garcinol）处理寄生虫后，虽然 TgGSK 的定位模式未变，但整体信号强度呈剂量依赖性下降，4μM 藤黄酸处理后信号消失。Western blot 分析也证实了这一结果，表明 GCN5b 可能在蛋白质水平上调节 TgGSK 的表达或稳定性。
9. TgGSK 敲低导致转录和剪接差异：由于 TgGSK 与转录因子 AP2IX - 7 和 AP2X - 8 存在于同一复合物中，研究人员对 TgGSK 敲低后的全局转录情况进行研究。RNAseq 分析发现，敲低 TgGSK 后，有 405 个基因表达下调，157 个基因表达上调。同时，对 RNAseq 数据中剪接变体的分析发现，敲低 TgGSK 后，有 131 个基因存在外显子差异。与 TgPPKL 敲低和藤黄酸处理的寄生虫进行对比，发现部分差异剪接转录本存在重叠，暗示 TgGSK 在正确剪接过程中发挥作用。

讨论

糖原合酶激酶（GSKs）广泛存在于多种生物中。哺乳动物通常有两种 GSK，即 GSK3α 和 GSK3β，参与细胞增殖、迁移、葡萄糖代谢和凋亡等过程；植物有 10 种 GSK，分为 4 个主要组，参与生长、发育和应激反应。弓形虫有两种假定的 GSK，本研究关注的 TgGSK 的定位依赖于细胞周期，且影响子代细胞形成、核分离、中心体动态、顶质体动态和剪接等多个过程，这与 GSK 通常具有的多效性特征相符。

中心体在内二芽殖中起着不可或缺的作用，它在有丝分裂时形成纺锤体微管，在胞质分裂时组织核裂变和细胞器分离的组件。顶质体在分裂前会伸长并与中心体相互作用，以确保正确的方向。研究人员通过 UExM 观察到 TgGSK 在中心体的定位，敲低 TgGSK 会导致中心体数量和分裂缺陷，进而影响核和顶质体的分离。此外，研究还发现中心蛋白 2 的磷酸化在 TgGSK 敲低时增加，暗示其与 TgGSK 的调节关系可能是间接的。

在其他生物中，GSK 对中心体的调节也有相关报道。在人类癌细胞中，抑制 GSK3β 会导致中心体失调和异常有丝分裂；在 HeLa 细胞中，GSK3β 参与组织源自中心体的微管阵列。虽然在缺乏 TgGSK 的情况下，有丝分裂纺锤体结合蛋白 EB1 的招募未受影响，但仍需进一步研究确定中心体蛋白或有丝分裂因子是否受到负面影响。

研究还发现，在缺乏 TgGSK 时，3 种 RNA 结合蛋白的磷酸化状态发生改变。在其他生物中，GSK 也参与剪接过程的调节。如在小鼠胚胎干细胞中，抑制 GSK3 会改变 188 种 mRNA 的剪接；在人类 T 细胞中，GSK3 对 PSF 的磷酸化调节 CD45 的可变剪接。尽管植物 GSK 同源物 BIN2 参与剪接的直接证据不足，但其信号网络包含 13 种 RNA 加工蛋白。

本研究的一个重要发现是赖氨酸乙酰转移酶 GCN5b 对 TgGSK 的潜在调节作用。TgGSK 与含有 GCN5b 的复合物相互作用，抑制 GCN5b 会导致 TgGSK 特异性缺失。研究推测，GCN5b 可能通过乙酰化调节 TgGSK，在细胞核中，GCN5b 可能对 TgGSK 的 K13 位点进行乙酰化，随后 TgGSK 被转运到细胞质和中心体准备细胞分裂；分裂结束后，TgGSK 可能在 K13 位点发生去乙酰化和泛素化，进而被降解。

总体而言，本研究揭示了 TgGSK 在弓形虫中的多种重要作用。虽然已确定其在中心体和剪接方面可能的作用，但仍需进一步研究这些功能的具体机制。由于 TgGSK 对弓形虫的生存和分裂至关重要，使其成为抗寄生虫干预的潜在重要靶点，为开发新型抗弓形虫药物提供了理论依据和研究方向。