开发与优化针对人类 T 细胞白血病病毒包膜蛋白的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）检测方法及其重要意义

《Journal of Virology 4.0》：Development and optimization of human T-cell leukemia virus-specific antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) assay directed to the envelope protein

本文开发了一种基于高通量流式细胞术的检测系统，用于测量人类 T 细胞白血病病毒 1 型（HTLV-1）包膜特异性抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）。该检测系统有助于研究包膜特异性结合抗体在 HTLV-1 感染免疫控制和发病机制中的作用，为治疗和预防性疫苗开发提供关键工具。

　　### 引言
人类 T 细胞白血病病毒 1 型（HTLV-1）能引发机体产生强烈的抗体和细胞免疫反应，但却会在体内建立终身持续性感染。目前，在理解 HTLV-1 的分子机制和传播方面虽有进展，但在宿主免疫反应和有效治疗方法的研究上仍有不足。

人体在接触 HTLV-1 几周后，体内会产生抗病毒抗体和细胞免疫反应，不同个体产生针对病毒不同蛋白的抗体情况各异，且抗体水平与疾病状态、病毒载量之间的关系也尚不明确，这使得抗 HTLV 抗体对疾病进展的影响难以完全明晰。

抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）是机体对抗细胞相关病毒感染的重要防御机制，主要由自然杀伤细胞（NK 细胞）通过 CD16（FcgRIII）受体介导，可杀伤被病毒感染的细胞，理论上对 HTLV-1 感染细胞也有杀伤作用。然而，此前缺乏检测 HTLV-1 包膜特异性抗体介导 NK 细胞杀伤作用的试剂，限制了相关研究。

结果

1. CEM-NK^R-ENV1 细胞系的构建与鉴定：以往检测 HTLV 感染个体血浆中 ADCC 抗体滴度常用的 HTLV-1 转化细胞系 MT2 和 C91PL，对 NK 细胞直接杀伤敏感，且会产生感染性病毒，影响 ADCC 检测的准确性。研究人员将 HTLV-1A 包膜 cDNA 克隆到带有嘌呤霉素筛选标记的慢病毒载体中，转导 CEM-NK^R-EGFP 细胞，成功构建出稳定表达 HTLV-1 包膜蛋白的 CEM-NK^R-ENV1-EGFP 细胞系。经检测，该细胞系表达 HTLV-1 包膜蛋白，且表面表达水平较低。
2. 高通量流式细胞术 ADCC 检测：MT2 和 C91PL 细胞在 ADCC 检测中未显示出特异性 ADCC 活性，而 CEM-NK^R-ENV1-EGFP 细胞系中的 ENV1a 细胞对包膜特异性 NK 细胞裂解更敏感，因此被用于后续研究。用 HTLV-1 感染个体和健康供体的血浆进行检测，发现感染个体血浆具有较高的 ADCC 活性和抗体滴度，且部分个体血浆中的 ADCC 可能针对构象性包膜表位，但 ADCC 活性与原病毒载量、ADCC 抗体滴度与包膜抗体滴度之间未发现相关性。
3. 感染 HTLV-1 或 HTLV-2 的猕猴具有包膜特异性 ADCC 活性：猕猴易感染 HTLV-1A 和 HTLV-2，研究人员检测了实验感染猕猴和未感染对照猕猴的血浆样本。结果显示，HTLV-1 感染猕猴血浆中存在包膜特异性 ADCC 活性，且 ADCC 滴度与 HTLV-1 p24Gag 和包膜抗体滴度呈正相关；HTLV-2 感染猕猴血浆也有交叉反应性的包膜特异性 ADCC 活性，但由于动物数量较少，未发现其 ADCC 活性、抗体滴度与原病毒载量之间的相关性。
4. 不同 HTLV-1 感染克隆感染过程中 ADCC 活性的变化：HTLV-1 分为多个亚型，研究人员用 HTLV-1A 或嵌合的 HTLV-1A/C 病毒感染恒河猴，观察感染过程中 ADCC 活性和抗体滴度的变化。结果发现，感染后 ADCC 杀伤百分比和抗体滴度随时间显著增加，且在感染早期，感染 HTLV-1A/C 的三重耗竭动物血浆中 ADCC 杀伤活性高于感染 HTLV-1A 的动物。
5. HTLV-1 感染诱导的免疫反应与 ADCC 反应的相关性：对实验感染猕猴的纵向研究进行相关性分析，发现感染后第 5 周，单核细胞频率和经典单核细胞频率与 ADCC 滴度呈负相关，而 IL-17F 和 FLT3LG 与 ADCC 滴度呈正相关；感染后第 12 周，ADCC 滴度和杀伤活性与淋巴细胞计数、CD4⁺T 细胞计数呈正相关；感染后第 21 周，未发现 ADCC 与其他免疫参数的相关性。

讨论

宿主对病毒持续感染的控制机制对于开发有效疫苗和治疗慢性感染病原体的药物至关重要。HTLV-1 感染相关疾病的发生发展与机体对病毒的免疫反应密切相关，但目前宿主免疫反应在疾病发展差异中的作用仍不清楚。

ADCC 在控制病毒感染中起重要作用，尤其是对于通过细胞间传播和感染细胞增殖的病毒。以往检测 ADCC 诱导的 HTLV-1 抗体的方法存在诸多局限性，如靶细胞对 NK 细胞直接杀伤敏感、产生感染性病毒等。本研究开发的基于 NK 抗性细胞且仅表达 HTLV-1 包膜蛋白的敏感高通量检测方法，克服了这些局限性，可量化 HTLV-1 感染个体和实验感染猕猴血浆中的包膜特异性抗体杀伤活性和 ADCC 滴度。

研究发现，ADCC 杀伤活性和抗体滴度随感染时间增加，且在不同病毒感染和细胞耗竭条件下存在差异。同时，ADCC 与部分细胞群体和细胞因子在特定时间点存在相关性，但与 p24Gag 抗体滴度和原病毒载量无相关性，这表明细胞群体的变化可能会影响抗体对病毒的反应。

本研究也存在一定局限性，如 CEM-NK^R-ENV1a-EGFP 细胞系中 HTLV-1 抗原表达频率较低，虽能产生特异性 ADCC 反应，但后续可通过连续稀释等技术优化。总体而言，新开发的 ADCC 检测方法为 HTLV 相关临床、治疗和疫苗研究提供了重要工具。

材料和方法

1. 质粒：将 HTLV-1A 包膜 cDNA 合成并克隆到 pUC-Zeo 载体，插入 HA 标签，经酶切和连接后构建到慢病毒载体 pLVX-IRES-Puro 中。
2. 细胞系和稳定 CEM-NK^R-ENV1-EGFP 细胞的建立：培养多种细胞系，通过转染和慢病毒转导技术，用嘌呤霉素筛选获得稳定表达 HTLV-1 包膜蛋白的 CEM-NK^R-ENV1-EGFP 细胞系。
3. HTLV-1 原病毒载量：采用实时 PCR 技术，以特定引物和探针检测 HTLV-1 原病毒载量，通过标准曲线计算原病毒 DNA 水平。
4. 效应细胞和血浆样本：分离健康人外周血单个核细胞（PBMCs）作为效应细胞，收集猕猴和人的血浆样本用于检测。
5. ADCC 流式细胞术检测：以 CEM-NK^R-ENV1-EGFP 细胞为靶细胞，标记后与血浆或抗体孵育，加入效应细胞培养，通过检测靶细胞 GFP 的丢失来测量 ADCC 活性，并计算归一化 ADCC 活性和 ADCC 终点滴度。
6. 血浆 HTLV-1 包膜滴度：采用 ELISA 方法检测血浆中 HTLV-1A 包膜抗体滴度。
7. 猕猴模型中的病毒接种和处理：对未感染相关病毒的恒河猴分组，部分进行细胞耗竭处理，然后接种 HTLV-1A 或 HTLV-1A/C 病毒，定期采集血液样本。
8. 细胞群体和细胞因子谱：对新鲜全血染色后，用流式细胞术检测细胞群体；采用邻近延伸分析（PEA）技术检测血浆细胞因子水平。
9. 统计分析：使用多种统计方法进行数据分析，以判断数据的差异和相关性，P 值小于 0.05 认为具有统计学意义。