补体样毒素成孔活性的结构基础揭示CDC-like蛋白家族的新型成孔机制

《SCIENCE ADVANCES》：Structural basis for the pore-forming activity of a complement-like toxin

编辑推荐：本研究针对CDC-like蛋白（CDCLs）成孔机制不明的科学问题，通过X射线晶体学和冷冻电镜技术解析了CDCLL/CDCLS异源复合物的活化态、前孔态及跨膜孔态结构，首次揭示这类肠道菌群毒素通过蛋白酶激活和双组分协同作用形成β桶状跨膜孔的分子机制，为理解MACPF/CDC超家族进化关系提供了新视角。论文发表于《Science Advances》。

　　在微生物的军备竞赛中，孔形成蛋白（PFPs）如同分子级别的"穿甲弹"，能穿透细胞膜造成致命损伤。其中胆固醇依赖性溶细胞素（CDC）和膜攻击复合物/穿孔素（MACPF）家族因能形成纳米级跨膜孔而备受关注。然而，近年来在肠道菌群中新发现的CDC-like蛋白（CDCLs）家族虽与CDC共享五氨基酸基序，却展现出独特的双组分（CDCL^L/CDCL^S）作用模式和蛋白酶激活特性，其成孔机制始终是未解之谜。

中国科学院生物物理研究所的研究团队选择Elizabethkingia anophelis来源的CDCLs为研究对象，通过多尺度结构生物学方法揭示了这类毒素的完整成孔途径。研究首先利用X射线晶体学解析了蛋白酶K激活后的CDCL^L（act-EaCDCL^L）结构，发现其D2区β1链的激活环被切除后，核心β5链发生1.2?位移，暗示了寡聚化界面的暴露。冷冻电镜技术则成功捕获到30聚体的前孔样中间体和跨膜孔结构，分辨率分别达3.13?和2.87?。令人惊讶的是，CDCL^S的成孔过程完全颠覆了CDC家族的经典模式——无需D4结构域介导的垂直塌陷，其α螺旋束（α-HBs）直接展开为跨膜发夹（TMHs），形成直径167?的β桶状孔道。通过AlphaFold2预测模型与实验数据的整合，研究还揭示了单分子CDCL^L通过其独特D4结构域锚定膜表面，进而招募29个CDCL^S分子组装的精确调控机制。

关键技术方法包括：1）蛋白酶的梯度激活优化获得稳定单体；2）SEC-MALS和SAXS验证溶液状态构象；3）脂质体释放实验验证功能活性；4）冷冻电镜单颗粒分析解析膜嵌入孔结构；5）AlphaFold2预测辅助建模。

研究结果部分：

1. 蛋白酶激活导致激活环丢失：晶体结构比较显示，act-EaCDCL^L失去25个氨基酸的激活环，D3核心β片层发生构象重排，为后续寡聚化创造条件。
2. CDCL孔复合体的冷冻电镜结构：30聚体孔道呈现平滑外表面，与CDC孔道（如肺炎链球菌溶素PLY）的"尖刺状"外观形成鲜明对比，内径（167?）显著小于典型CDC孔（260?）。
3. 前孔结构揭示中间态构象变化：β5链完全转变为α螺旋（HTH模体），形成内部α桶，但α-HBs尚未展开，这一特征与MACPF家族更为相似。
4. 与CDC、MACPF和GSDM家族的结构比较：CDCLs兼具CDC的β桶拓扑和MACPF的连续环状组装特性，其成孔机制可能代表了这两大家族的进化中间态。

结论与讨论部分指出，CDCLs代表了一类独特的"分子钻头"，通过三重调控机制确保精准打击：1）蛋白酶激活解除自抑制；2）CDCL^L特异性膜定位；3）β5-HTH转换触发寡聚化。这种机制既不同于CDC的胆固醇依赖模式，也有别于MACPF的补体级联激活或gasdermin（GSDM）的C端自抑制。特别值得注意的是，CDCL^S的结构简约性暗示其可能是MACPF/CDC超家族的原始蓝本，而bGSDM的发现则为理解这三大家族的进化关系提供了关键线索。该研究不仅为开发针对肠道菌群竞争的抗菌策略提供了新靶点，其揭示的"双组分协同成孔"机制也为人工设计可控纳米孔道带来了启示。