新型衣壳修饰的 HDAd 载体介导人源化小鼠体内造血干细胞转导：开启基因治疗新征程

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：In vivo HSC transduction in humanized mice mediated by novel capsid-modified HDAd vectors

本文构建了人源化小鼠模型，通过不同动员方案结合新型衣壳修饰的辅助依赖型腺病毒（HDAd）载体进行体内造血干细胞（HSC）转导研究。发现 HDAd6/3 等载体能高效转导 HSC，为血红蛋白病和 HIV 等疾病的基因治疗临床转化提供了重要依据。

　　

一、研究背景与目的

在基因治疗领域，造血干细胞（HSC）基因疗法是极具潜力的研究方向。辅助依赖型腺病毒（HDAd）载体因具备多种优势，成为 HSC 基因治疗的重要工具。它能靶向 HSC 受体 CD46 或 DSG2（desmoglein 2），拥有高达 35kb 的有效载荷容量，可作为游离型或整合型载体，且生产成本低、产量高。

此前研究多在小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中开展，使用的 HDAd5/35++ 载体虽有一定成果，但仍存在优化空间。为进一步提升 HDAd 载体在体内 HSC 基因转移中的效用，研究人员对其进行了多种衣壳修饰，如将血清型从 Ad5 切换到 Ad6，改变靶向纤维旋钮等。

然而，不同物种对 HDAd 载体的反应存在差异，小鼠体内 CD46 的表达模式与人类不同，而构建的人类 DSG2 转基因小鼠中 DSG2 在 HSCs 中不表达，使得相关研究受限。因此，人源化小鼠模型成为评估体内 HSC 转导疗效的关键工具。本研究旨在利用人源化小鼠模型，探究新型 HDAd 载体对人类 HSCs 的体内转导效果，为相关疾病的基因治疗提供更坚实的基础。

二、实验材料与方法

1. 实验动物：选用免疫缺陷的 NOD.Cg-Kit^W-41J Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/WaskJ（NSGW41）小鼠，经部分骨髓消融（12.5mg/kg 白消安（busulfan，BU）处理）后，移植人类健康供体的 CD34⁺细胞，构建人源化小鼠模型。
2. 实验试剂：包括用于预处理的白消安，动员和体内转导的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、AMD3100、地塞米松磷酸钠，以及 CXCR2 抑制剂 tGroβ（MGTA-145）、VLA4 抑制剂 WU-106 等。
3. HDAd 载体构建与生产：构建了多种 HDAd 载体，如 HDAd5/35、HDAd6/3、HDAd5/35_lam 等。HDAd5/35 的 Ad5 衣壳纤维被 Ad35 纤维替代，且增强了 Ad35 纤维与 CD46 的亲和力；HDAd6/3 源自 Ad6 血清型，其 Ad6 纤维旋钮被 Ad3 纤维旋钮取代，并增强了 Ad3 纤维旋钮与 DSG2 的亲和力；HDAd5/35_lam 则是在 HDAd5/35 基础上，将 Ad5 penton 中的 RGD（Arg-Gly-Asp）基序替换为源自层粘连蛋白链 A 的 SIKVAV（Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val）基序，以靶向 α₆β₁/CD49f 受体。所有 HDAd 载体均含有由 EF1a 启动子驱动 mgmt^P140/GFP 盒的相同转基因盒，HDAd-SB 用于介导 mgmt/GFP 盒的整合。这些载体通过相应质粒线性化后在 116 细胞中拯救制备，辅助病毒污染水平低于 0.05%，滴度达 3 - 9×10¹² vp/mL。
4. 实验方法
   • SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：用于分析病毒蛋白，将病毒蛋白在特定缓冲液中处理后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经银染显示蛋白条带。
   • 动态光散射：测定 Ad 颗粒大小，将 Ad 颗粒稀释后用 Malvern Zetasizer Nano - S Series 进行检测。
   • RBC 结合试验：评估 HDAd5/35、HDAd5/35_lam 和 HDAd6/3 与血细胞的结合能力，以 HDAd5 为阳性对照，用人类全血与病毒颗粒孵育，离心分离血浆、红细胞和 PBMCs，提取 DNA 后进行实时定量 PCR 检测。
   • 细胞培养与分化：获取新鲜和冷冻的人类 CD34⁺细胞，复苏后在特定培养基中培养，并用 HDAd5/35 - GFP 或 HDAd6/3 - GFP 载体联合 HDAd - SB 载体进行转导，之后分别进行体外红细胞和髓细胞分化培养。
   • 动物实验流程：人源化小鼠构建 6 周后，采用不同方案进行 HSCs 动员，如 G-CSF（250μg/kg，皮下注射，1 - 6 天）联合 AMD3100（5mg/kg，腹腔注射，5 - 7 天），或使用 tGroβ 联合 AMD3100，以及 tGroβ、WU - 106 和 AMD3100 联合方案。在动员高峰期，静脉注射相应 HDAd 载体和 HDAd - SB 载体。1 个月后，腹腔注射 O⁶BG（30mg/kg，分两次，间隔 30 分钟）和 5mg/kg BCNU 进行体内转导细胞的选择。1 个月后处死小鼠，收集造血组织进行分析。
   • 检测方法：通过细胞表面染色和流式细胞术评估细胞表型、分化情况和多系植入情况；利用磁珠分选技术分离特定细胞；提取细胞 DNA 进行实时定量 PCR 分析转基因拷贝数（VCN）；采用 GraphPad Prism 10.0.3 软件进行统计学分析，以 p 值小于 0.05 为具有统计学意义。

三、实验结果

1. HDAd 载体特性
   • 通过 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现不同 HDAd 载体的主要衣壳蛋白如六邻体（~108kDa）、五邻体基底（~68kDa）和纤维（~61kDa）存在差异，HDAd6/3 等基于 Ad6 的载体在约 75kDa 处有不同大小的疑似纤维条带和额外条带。动态光散射分析显示，HDAd6 衍生的颗粒（如 HDAd6/3）比 Ad5 衍生的 HDAds（HDAd5/35 和 HDAd5/35_lam）更大。
   • RBC 结合试验表明，HDAd5/35、HDAd5/35_lam 和 HDAd6/3 不与红细胞结合，且 HDAd5/35_lam 和 HDAd6/3 不与 PBMCs 结合，这意味着新型载体在静脉注射后不易被红细胞捕获，更有利于到达靶细胞。
   • 流式细胞术研究证实，CD46 和 DSG2 在原始人类 HSCs（如 CD34⁺/CD90⁺细胞）上高表达，为 HDAd 载体靶向这些细胞提供了基础。
2. 体外转导实验：使用 HDAd5/35 - GFP 和 HDAd6/3 - GFP 对人类 CD34⁺细胞进行体外转导实验。结果显示，HDAd6/3 - GFP 对人类 CD34⁺细胞，尤其是更原始的 CD34⁺/CD38^?/CD90⁺细胞的转导效率显著高于 HDAd5/35 - GFP。在长期培养实验中，经 O⁶BG/BCNU 筛选后，HDAd6/3 - GFP 转导的细胞在红细胞和髓细胞祖细胞集落以及分化细胞中，GFP 表达阳性率更高，且 HDAd6/3 - GFP 转导导致的细胞应激信号（通过活性氧（ROS）平均荧光强度衡量）更低。
3. 体内转导实验
   • 提高人源化程度和动员效率：研究发现，新鲜分离的人类 CD34⁺细胞在 NSGW41 小鼠中的植入率高于冷冻保存的细胞。对于冷冻保存的细胞，12.5mg/kg 白消安预处理可显著提高其在小鼠外周血中的人源化程度（6 周后，人 CD45⁺细胞百分比显著增加），并促进 G-CSF + AMD3100 对人类 CD34⁺细胞的动员，使外周血中循环的人类 CD45⁺/CD34⁺细胞百分比显著提高。
   • 不同载体的体内转导效果：在人源化小鼠体内转导实验中，HDAd6/3 - GFP 载体在体内转导 / 选择后，外周血中人类 CD45⁺/GFP⁺细胞百分比显著高于 HDAd5/35 - GFP 载体（41.12% [10.62%] vs. 22.38% [8.17%]），在骨髓和脾脏中也呈现类似趋势。HDAd5/35_lam - GFP 载体在注射后 3 天，对骨髓中人类 CD34⁺细胞和更原始细胞亚群的转导效率更高，但在长期研究中，其在原始 HSCs 中的高标记率未转化为外周血和脾脏中人类细胞的高标记率。
   • 不同动员方案的影响：比较 G-CSF + AMD3100、tGroβ + AMD3100 和 tGroβ + WU - 106 + AMD3100 三种动员方案，发现 tGroβ + AMD3100 和 tGroβ + WU - 106 + AMD3100 能更高效、快速地动员原始人类 CD34⁺/CD90⁺ HSCs。在使用 HDAd6/3 - GFP 载体进行体内转导后，经 O⁶BG/BCNU 选择，G-CSF + AMD3100 动员的小鼠外周血和骨髓中 GFP⁺/ 人类 CD45⁺细胞百分比最高，但在脾脏中，tGroβ + AMD3100 和 tGroβ + WU - 106 + AMD3100 动员的小鼠有较高比例的 GFP 阳性人类 CD34⁺细胞。

四、研究结论

1. 本研究成功构建了人源化小鼠模型，优化了人源化程度和 HSCs 动员方案。低剂量白消安预处理可有效提高冷冻保存的人类 CD34⁺细胞在 NSGW41 小鼠中的植入率和动员效率，为后续体内转导实验奠定了良好基础。
2. 新型 HDAd 载体展现出良好的应用潜力。HDAd6/3 载体在体外和体内实验中均表现出对原始 HSCs 的高效转导能力，在体内转导 / 选择后，能在 PBMCs 和骨髓单核细胞中实现较高比例的 GFP 标记，有望为血红蛋白病和 HIV 等疾病的基因治疗提供有效手段。HDAd5/35_lam 载体虽在原始 HSCs 转导上有优势，但在细胞分化和迁移方面可能存在问题，其在长期研究中的效果还需进一步探索。
3. G-CSF-free 动员方案（如 tGroβ + AMD3100 和 tGroβ + WU - 106 + AMD3100）在动员原始 HSCs 方面表现出色，能减少载体被定向细胞捕获，提高原始 HSC 的转导效率，为临床应用提供了新的动员策略选择。
4. 人源化小鼠模型在体内 HSC 转导研究中具有重要价值，但也存在局限性，如小鼠健康状况不佳、人类造血祖细胞分化不完全等。未来需要进一步改进模型或探索新的研究方法，以推动 HSC 基因治疗的临床转化。
5. 总体而言，本研究为体内 HSC 基因治疗提供了重要的实验依据和理论支持，新型 HDAd 载体和动员方案的研究成果为相关疾病的治疗带来了新的希望，后续研究可在此基础上进一步优化，加速基因治疗的临床应用进程。