揭秘 Irx 同源框基因：调控运动神经元发育的关键密码

《iScience》：The Iroquois (Iro/Irx) homeobox genes are conserved Hox targets involved in motor neuron development

在神经系统发育研究中，Iroquois（Iro/Irx）同源框基因的表达、功能及调控尚不明确。芝加哥大学研究人员对小鼠胚胎脊髓中 Irx 基因展开研究，发现其在运动神经元（MNs）发育中的关键作用及与 HOX 基因的调控关系，为神经系统发育研究提供新视角。

　　在生命的奇妙旅程中，神经系统的发育一直是科学界热衷探索的神秘领域。Iroquois（Iro/Irx）同源框基因作为一类编码保守同源域转录因子的基因家族，在动物发育过程中扮演着极为重要的角色。它们不仅参与早期胚胎的模式形成和细胞特化，还在后期组织分化和功能维持中发挥作用。然而，尽管 Irx 基因与人类多种先天性疾病存在关联，可我们对其在神经系统，尤其是在脊髓中的表达模式、具体功能以及精确的调控机制知之甚少。这就好比在黑暗中摸索，急需一束光来照亮前行的道路。

为了填补这些知识空白，来自美国芝加哥大学（University of Chicago）的研究人员挺身而出，勇敢地踏上了探索之旅。他们聚焦于小鼠胚胎脊髓，对所有六个小鼠 Irx 基因展开了深入且系统的研究。经过不懈努力，研究取得了丰硕成果，相关论文发表在《iScience》杂志上。这一研究不仅为我们揭示了 Irx 基因在脊髓运动神经元（MNs）发育过程中的关键作用，还发现了 HOX 蛋白与 Irx 基因之间古老而神秘的调控关系，犹如一把钥匙，为我们打开了理解神经系统发育奥秘的新大门。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是 RNA 原位杂交（RNA in situ hybridization）技术，通过该技术能够直观地观察到基因在组织细胞中的表达位置和水平；二是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，利用这一强大工具构建了 Irx2、Irx5 和 Irx6 的突变小鼠模型，从而深入探究这些基因在运动神经元发育中的功能；三是单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，借助它可以在单细胞水平上分析基因表达情况，极大地提高了研究的分辨率。

研究结果如下：

• Irx 基因在小鼠脊髓运动神经元中的表达图谱：研究人员系统地研究了六个小鼠 Irx 基因在胚胎脊髓臂丛（C4-T1）区域的表达情况。通过 RNA 原位杂交和 RNA 荧光原位杂交（RNA fluorescent in situ hybridization）等技术发现，Irx1、Irx2、Irx3、Irx5 和 Irx6 在脊髓的不同区域和特定的运动神经元群体中呈现出独特且有重叠的表达模式。例如，Irx1 主要在 MMC 神经元中表达，而 Irx6 则特异性地在 LMC 神经元的 Pea3 池中表达。这一详细的表达图谱为进一步研究这些基因在运动神经元发育中的功能奠定了坚实基础。
• IRX6 在人类运动神经元中的表达：为了探究 Irx 基因在运动神经元中的表达是否在进化上具有保守性，研究人员利用人类胚胎干细胞（hESC）分化产生运动神经元，并进行免疫荧光检测。结果发现，IRX6 在人类的运动神经元中同样有表达，且与小鼠脊髓中 Irx6 的表达模式一致，这表明该基因在运动神经元中的功能可能在进化过程中得以保留。
• Irx 基因在脊髓不同区域的表达差异：研究人员进一步研究了 Irx 基因在脊髓胸段和腰段的表达情况，发现 Irx2 不仅在臂丛区域的 LMC 和 MMC 神经元中表达，在胸段和腰段的 MMC 神经元中也有表达，这说明 Irx2 可以标记胚胎脊髓中不同区域的 MMC 神经元。同时，Irx2、Irx5 和 Irx6 在臂丛和腰段的 LMC 神经元中均有表达，揭示了这些基因在不同区域 LMC 神经元发育中的潜在共同作用。
• Irx2 对肢体支配运动神经元发育的重要性：通过 CRISPR-Cas9 技术构建的 Irx2 突变小鼠模型（Irx2^Δ5bp/Δ5bp）研究发现，在 e12.5 时，突变小鼠臂丛脊髓中 LMC 神经元的数量显著减少，但不影响 Pea3 表达的神经元数量。不过，突变小鼠的轴突投射和前肢抓握力并未受到明显影响。这表明 Irx2 对于肢体支配运动神经元的发育至关重要，但其具体作用机制仍有待进一步深入研究。
• Irx5 在运动神经元发育中的作用：同样利用 CRISPR-Cas9 技术构建 Irx5 突变小鼠（Irx5^Δ5bp/Δ5bp），研究结果显示，该突变小鼠在 e12.5 和出生后第 10 天（p10），臂丛运动神经元的数量以及轴突投射均未出现明显变化。这表明 Irx5 在臂丛运动神经元的生成和轴突引导过程中并非必需，推测它可能与 Irx6 存在功能冗余。
• Irx6 对臂丛运动神经元数量的调控作用：构建 Irx6 突变小鼠（Irx6^{Δ19bp/Δ19bp}）后发现，与对照组相比，突变小鼠 e12.5 臂丛脊髓中 LMC 神经元（Foxp1 + 细胞）的数量在前端区域显著增加。进一步研究发现，这并非是由于 MN 祖细胞生成异常，而是可能与 Irx6 在调节 MN 细胞程序性死亡过程中的作用有关。这表明 Irx6 在限制臂丛（前端）区域 LMC 神经元数量方面发挥着重要作用。
• Hoxc8 对 Irx 基因表达的调控：研究人员发现，在小鼠脊髓臂丛区域，转录因子 Hoxc8 与 Irx 基因存在共表达现象。通过构建条件性敲除小鼠模型（Hoxc8^MNΔearly和 Hoxc8^MNΔlate）研究发现，Hoxc8 在早期发育阶段（e12.5 或更早）对于激活 Irx2、Irx5 和 Irx6 的表达至关重要，并且在后期发育阶段对于维持 Irx5 和 Irx6 的表达也必不可少。此外，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据表明，Hoxc8 可能直接作用于 Irx 基因的顺式调控区域，从而激活其表达。
• Hox 基因对 Irx 基因表达调控的进化保守性：为了探究 Hox 基因对 Irx 基因表达调控的进化保守性，研究人员以线虫（C. elegans）为模型展开研究。在线虫中，lin-39（Scr/Dfd/Hox3-5）与 irx-1 存在共表达现象。研究发现，lin-39 功能缺失突变体中，表达 irx-1 的 MN 数量显著减少。ChIP-seq 数据显示，LIN-39 能够直接结合到 irx-1 的顺式调控区域。这表明 Hox 蛋白对 Irx 基因表达的调控作用在进化上是古老且保守的。

研究结论和讨论部分具有重要意义。首先，该研究揭示了 Irx 基因在运动神经元发育中的关键作用，进一步丰富了我们对神经系统发育分子机制的认识。Irx 基因家族与 Hox、HB9/Mnx1 等其他同源框基因家族共同构成了调控运动神经元发育的复杂网络，它们之间相互协作，共同决定了运动神经元的命运和功能。其次，研究发现的 Hox 蛋白与 Irx 基因之间的调控关系，为我们理解基因调控的进化保守性提供了新的视角。这种古老的调控关系可能在神经系统发育过程中发挥着至关重要的作用，并且可能为研究其他物种的神经系统发育提供重要线索。此外，该研究也为进一步探究与 Irx 基因相关的人类先天性疾病的发病机制和潜在治疗靶点提供了理论基础。然而，研究也存在一定的局限性。例如，虽然发现了 Irx2 和 Irx6 在运动神经元发育中的重要作用，但仍需要通过条件性诱变等实验手段来进一步明确它们在祖细胞和成熟 MNs 中的具体作用机制。同时，由于 Irx 基因在脊髓 MNs 中的表达存在重叠，且有研究表明它们在心肌细胞中存在异源二聚化现象，因此需要进行联合突变分析，以揭示这些基因在脊髓中的潜在冗余功能。未来，随着研究的不断深入，有望进一步揭示 Irx 基因在神经系统发育中的更多奥秘，为神经系统疾病的治疗带来新的希望。