TDP-43 模板化聚集：解锁神经退行性疾病关键机制与潜在疗法的新钥匙

《Neuron》：TDP-43 seeding induces cytoplasmic aggregation heterogeneity and nuclear loss of function of TDP-43

本文聚焦 TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43），通过制备其淀粉样纤维，发现其可诱导 TDP-43 病理变化，包括细胞质聚集、核功能丧失等。该研究为解析 TDP-43 蛋白病机制提供关键线索，有望助力开发相关疾病治疗策略，值得关注。

　　

研究背景

TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）的细胞质聚集和核清除是多种年龄相关神经退行性疾病的关键病理标志，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）、阿尔茨海默病（AD）和边缘为主的年龄相关 TDP-43 脑病（LATE）等。TDP-43 主要是一种核 RNA 结合蛋白，在 RNA 代谢中发挥着转录、剪接、运输和翻译等重要作用 。其 C 末端低复杂性结构域（LCD）可通过液 - 液相分离（LLPS）促进去混合，调节其在 RNA 加工中的正常功能，但该结构域也极易聚集，相分离的液滴可能是病理性聚集体形成的反应中心。在患者中枢神经系统中，TDP-43 从细胞核中耗尽并在细胞质中积累，形成不溶性、泛素化和过度磷酸化的包涵体，导致核功能丧失和细胞质毒性增加，推动疾病进展。尽管已有研究进展，但 TDP-43 病理的分子机制仍不明确，缺乏可靠模拟其病理的细胞模型。

研究方法

1. 蛋白纯化与纤维制备：从大肠杆菌中纯化重组 TDP-43 LCD，经诱导使其自发组装成纤维状聚集体，通过超声处理获得小纤维片段（种子）。利用透射电子显微镜（TEM）、刚果红染色、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和硫黄素 - T（ThT）结合实验等方法对纤维和种子的形态、结构和性质进行表征。
2. 细胞实验：将种子转染到表达细胞质 TDP-43（TDP-43^mNLS-Clover）的 U2OS 细胞或野生型 U2OS 细胞中，观察 TDP-43 的聚集情况。通过免疫染色、荧光恢复后光漂白（FRAP）、荧光寿命成像显微镜（FLIM）等技术，研究聚集体的形态、动态特性和生物物理性质。同时，检测核 TDP-43 水平的变化，以及 RNA 剪接和转录组的改变。在部分实验中，使用蛋白酶体抑制剂处理细胞，观察对聚集体形态和降解的影响。
3. 神经元实验：利用人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为皮质样神经元（i3Neurons），并稳定表达 TDP-43^WT-Clover。将 TDP-43 LCD 纤维种子添加到神经元培养体系中，观察 TDP-43 的聚集、核清除、RNA 剪接变化以及细胞死亡情况。对非工程化的 iPSC 神经元进行相同处理，检测内源性 TDP-43 的病理变化。
4. 数据分析：运用多种软件和算法对实验数据进行处理和分析，包括图像分析、统计分析、RNA 测序数据处理等，以揭示 TDP-43 病理变化的机制和特征。

研究结果

1. TDP-43 LCD 形成淀粉样纤维并引发聚集：TDP-43 LCD 在体外可自发组装成长而无分支的丝状纤维，具有典型的淀粉样结构特征，如刚果红染色阳性、FTIR 光谱显示淀粉样特征峰、ThT 结合后荧光增强等。超声处理后的纤维种子能在无细胞体系中加速单体 TDP-43 LCD 的聚集，去除聚集动力学的滞后期。在细胞实验中，种子可诱导 U2OS 细胞中 TDP-43^mNLS-Clover 和内源性 TDP-43 形成细胞质聚集体，且聚集体中 TDP-43 发生磷酸化，这种诱导作用呈剂量依赖性。
2. 聚集体的形态和生物物理性质：纤维诱导的 TDP-43^mNLS-Clover 聚集体在不同时间呈现出不同的形态，包括致密聚集物、丝状聚集物和碎片化聚集物，且这些聚集体具有显著的异质性。FRAP 实验表明，聚集体具有固体样性质，与正常情况下 TDP-43^mNLS-Clover 形成的具有液体性质的凝聚物不同。FLIM 分析显示，纤维诱导的细胞质 TDP-43 聚集体的荧光寿命明显缩短，表明其具有与可溶性 TDP-43 不同的生物物理性质。
3. 核功能丧失：种子处理导致表达 TDP-43^mNLS-Clover 的 U2OS 细胞和野生型 U2OS 细胞中核内源性 TDP-43 水平显著降低。TDP-43 作为 RNA 剪接的关键调节因子，其核功能丧失导致 mRNA 转录本中异常掺入隐蔽外显子，如 FTD-ALS 风险基因 UNC13A 等。RNA 测序分析进一步证实了 TDP-43 聚集体细胞中存在与功能丧失相关的 RNA 剪接变化。
4. 蛋白降解途径的激活：TDP-43 细胞质聚集和核耗竭导致广泛的转录组变化，许多与神经退行性疾病、蛋白质稳态和代谢相关的基因表达上调，而一些已知的 TDP-43 结合靶基因表达下调。聚集体中 TDP-43 发生泛素化，且与泛素结合蛋白 p62 共定位，p62 基因表达上调。多种细胞蛋白质稳态途径相关的基因，如蛋白酶体、溶酶体、自噬相关基因和热休克蛋白基因等，在种子处理的细胞中差异表达。免疫染色显示，蛋白酶体和溶酶体标记物与 TDP-43 聚集体共定位，表明纤维诱导的 TDP-43 聚集可迅速招募蛋白质降解机制。
5. 聚集体的降解和清除：随着时间推移，TDP-43 聚集体的形态发生变化，从早期的致密聚集物逐渐转变为丝状和碎片化聚集物，这一过程与蛋白质降解途径的激活相关。蛋白酶体抑制剂可阻止聚集体的时间依赖性形态变化，表明这些变化至少部分由蛋白酶体介导。限制 TDP-43^mNLS-Clover 的表达可促进聚集体的清除，进一步证实了聚集体的降解过程。
6. 细胞毒性：在 U2OS 细胞中，TDP-43 聚集体的存在与细胞毒性无明显关联，细胞死亡概率在含有聚集体的细胞和含有弥散 TDP-43^mNLS-Clover 的细胞中无显著差异，但含有 TDP-43^mNLS-Clover 液滴的细胞死亡概率明显增加。在 iPSC 衍生的神经元中，纤维种子诱导的 TDP-43 聚集体与时间依赖性的细胞死亡相关，且毒性在含有聚集体的神经元中更为明显，表明 TDP-43 的错误定位和聚集对神经元健康有害。
7. 神经元中的 TDP-43 病理：在 iPSC 衍生的神经元中，TDP-43 LCD 纤维种子可诱导细胞质中 TDP-43^WT-Clover 聚集，伴随核清除和功能丧失，表现为隐蔽外显子的出现和 stathmin-2 蛋白水平降低。聚集体与泛素、p62 和蛋白酶体标记物共定位，但溶酶体标记物在聚集体周围无明显积累。纤维诱导的内源性 TDP-43 病理同样导致神经元毒性和细胞死亡。

研究结论

1. 本研究利用重组 TDP-43 LCD 纤维建立了模拟人类 TDP-43 蛋白病关键特征的细胞模型，为研究 TDP-43 病理机制提供了有力工具。
2. 证实了 TDP-43 模板化聚集是导致细胞质功能获得和核功能丧失的关键机制，支持了 TDP-43 聚集的朊病毒样范式。
3. 揭示了 TDP-43 聚集体的异质性源于其渐进性降解，不同形态的聚集体代表了降解过程的不同阶段。
4. 发现重组 TDP-43 LCD 纤维可诱导人类 iPSC 衍生神经元中的 TDP-43 病理变化，包括核功能丧失和细胞毒性，为研究散发性 TDP-43 蛋白病的发病机制和筛选潜在药物提供了有价值的模型。