综述：长读长测序时代的转录组学研究

这篇综述系统阐述了长读长测序技术（LRS）在转录组学领域的革命性进展，比较了牛津纳米孔（ONT）和太平洋生物科学（PacBio）两大平台的技术特点，详细解析了从实验设计、文库制备到数据分析的全流程，并展望了单细胞分辨率、RNA修饰检测等新兴应用方向。文章特别强调了LRS在解析全长转录本、复杂异构体（isoforms）和等位基因特异性表达方面的独特优势，为研究者提供了全面的技术路线图。

　　

在生命科学领域，转录组学研究正经历着由长读长测序技术（LRS）带来的范式变革。传统短读长测序（srRNA-seq）虽然革新了基因表达分析，但其100-300bp的读长限制难以解析远端外元的连接关系，也无法直接检测RNA表观转录组修饰。而LRS技术通过纳米孔（ONT）和单分子实时测序（SMRT）两大平台，实现了对全长转录本的单分子捕获，为揭示转录组复杂性开辟了新维度。

实验设计环节中，RNA完整性（RIN>8）成为关键制约因素。降解样本会导致转录起始位点（TSS）和终止位点（TTS）的识别偏差，特别是影响多聚腺苷酸尾（poly(A)）长度测量。ONT的RNA004化学试剂和PacBio的SPRQ技术显著提升了测序通量，单个PromethION或Revio运行可分别产生1.3亿和1亿条读长。值得注意的是，Kinnex/MAS-seq文库制备技术通过cDNA分子串联，将通量提升20倍的同时，也带来了转录本截短的风险。

在技术比较方面，PacBio的HiFi模式凭借环状共识测序（CCS）可实现>99%的准确率，特别适合精确量化低频异构体；而ONT直接RNA测序（dRNA-seq）则保留了表观修饰信息，其纳米孔电流信号可检测m⁶A等修饰碱基。创新性文库制备方法如R2C2通过分子环化将ONT准确率提升至94-99%，CapTrap-seq则通过5'端生物素标记解决了降解产物的富集偏差。

数据分析流程呈现多元化发展态势。基础处理环节，Minimap2仍是主流比对工具，但针对小外元检测优化的uLTRA和Graphmap2展现出特殊价值。转录本重建算法可分为三类：基于聚类的FLAIR和Mandalorion通过共享剪接位点分组；基于图的IsoQuant和StringTie2构建剪接图谱；基于分类的Bambu则采用机器学习筛选高可信度新转录本。特别值得关注的是，LRGASP基准测试显示，即使最优算法对中等表达量转录本的检测精确度也不足60%，这凸显了实验验证的必要性。

在应用层面，LRS已揭示出令人振奋的生物学发现：脑区特异性剪接事件与神经精神疾病的关联、癌症中新型基因融合（gene fusion）的鉴定、胸腺发育过程中可变TSS的动态调控等。单细胞长读长测序（scIso-Seq）成功绘制了神经元亚群的异构体图谱，而空间转录组与LRS的结合则实现了亚细胞分辨率的异构体定位。等位基因特异性分析工具如LORALS和FLAIR2，能够解析HLA等高度多态性基因的表达差异。

技术挑战依然存在：ONT的插入缺失错误（indels）影响剪接位点识别，而PacBio的ZMW孔尺寸限制导致长转录本丢失。新兴的适应性采样（adaptive sampling）技术通过实时选择靶标分子，将稀有转录本检测灵敏度提升5-10倍。未来，R10.4纳米孔和Sequel II系统的性能优化，以及深度学习算法在碱基识别中的应用，有望进一步突破当前的技术瓶颈。

这场技术革命正在重塑我们对转录组复杂性的认知。从基础研究角度看，LRS揭示的数千种新异构体挑战着现有基因组注释的完整性；在临床转化方面，其识别癌症特异性融合转录本和RNA修饰模式的能力，为精准医疗提供了新型分子标志物。随着长读长测序成本曲线的持续下降，我们有理由预见，全面解析"一个基因-多种转录本-动态修饰"的三维转录组时代即将到来。