编辑推荐：
为探究如何调控金属酶外球相互作用影响其功能，研究人员设计了新型人工铜蛋白（ArCuPs）。通过对比 3SCC 和 4SCC，发现 4SCC 因溶剂重组能高而无 C-H 过氧化活性，破坏特定氢键可恢复其活性。该研究为金属酶设计提供新思路。
在生命的微观世界里，金属酶扮演着至关重要的角色，它们参与了呼吸、电子转移（ET）、生物质降解等众多生化过程。然而，想要精准控制金属酶外球相互作用来影响其功能，却如同在错综复杂的迷宫中寻找出口，充满挑战。就拿含铜（Cu）的金属蛋白来说，不同的 Cu 中心结构，像类型 1 Cu 中心仅参与电子转移，类型 2 Cu 蛋白则可参与电子转移或催化，但其活性位点在不同蛋白质矩阵中的表现差异极大，使得人们难以弄清楚配位环境、远程相互作用等因素究竟如何影响电子转移、溶剂重组能（
λ）以及对
H2O2/
O2的反应性，进而决定金属酶的最终功能。在这种背景下，来自美国密西西比大学（University of Mississippi）等机构的研究人员，踏上了探索之旅，开展了一项旨在揭示金属酶功能调控机制的研究。
研究人员巧妙地设计了人工铜蛋白（ArCuPs），构建了具有不同配位结构的三聚体（3SCC）和四聚体（4SCC）自组装体。其中，3SCC 中的 Cu 以三角Cu(His)3配位，4SCC 中的 Cu 则是四方锥Cu(His)4(OH2)配位。他们通过一系列实验研究，得出了令人瞩目的结论。研究发现，3SCC 能够高效地电催化 C-H 氧化，而 4SCC 却没有这种活性。进一步研究表明，4SCC 的无活性是由于特定的 His---Glu 氢键介导了较高的溶剂重组能障碍。当这个氢键被破坏后，溶剂重组能降低，4SCC 竟然恢复了 C-H 过氧化活性。这一发现就像是找到了一把钥匙，能够开启或关闭金属酶的功能，为理解金属酶的作用机制和设计新型金属酶提供了全新的视角，意义重大。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域的发展注入了新的活力。
为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在结构解析方面，利用 X 射线晶体学技术，成功解析了 4SCC 和相关突变体的晶体结构，直观地观察到蛋白质的空间构象和原子配位情况。光谱技术也发挥了重要作用，如 UV-vis 光谱和 EPR 光谱，用于监测金属酶在反应过程中的电子转移和氧化态变化，获取其电子结构信息。此外，电化学方法，包括蛋白质膜伏安法、旋转圆盘电化学（RDE）和计时电流法（CA），用于测定金属酶的氧化还原性质和重组能，从电化学角度深入探究其反应机制 。
下面来详细看看研究结果：
- 模块化肽组装设计：研究人员利用从头设计蛋白质的方法，通过控制七肽重复序列（(abcdefg)）中 a 和 d 位点的疏水残基（如 Ile 和 Leu），成功构建了 3SCC 和 4SCC 自组装体。这种设计策略就像是搭建乐高积木一样，通过改变不同的模块，实现了对蛋白质寡聚状态和活性位点配位环境的精准调控，为后续研究奠定了坚实基础。
- 4SCC 的结构和电子性质：X 射线晶体学分析显示，4SCC 呈现出预期的四聚体结构，Cu 与四个 His 配位形成近似四方锥的Cu(His)4OH2结构。电子光谱和 EPR 光谱进一步揭示了其电子结构特征，表明 4SCC 具有高度的结构均一性，为理解其反应活性提供了结构依据。
- 3SCC 和 4SCC 的反应性差异：电化学实验表明，3SCC 能够有效地催化H2O2还原和苄基 C-H 底物的氧化、过氧化反应，而 4SCC 则几乎没有这些活性。这一差异表明，金属配位环境的改变对 ArCuPs 的反应性有着决定性影响，就像不同的钥匙只能打开特定的锁一样。
- 3SCC 比 4SCC 更容易还原：通过 Trp 荧光监测 Cu 的氧化态变化，研究人员发现 3SCC 被抗坏血酸（Asc）还原的速度比 4SCC 快得多。这一结果与它们的配位结构密切相关，说明Cu(His)3结构更有利于容纳还原态的 Cu，进一步解释了两者反应活性差异的原因。
- H2O2和O2依赖的再氧化：研究人员分别用H2O2和O2对还原态的 ArCuPs 进行再氧化实验。结果显示，3SCC 与H2O2反应更快，生成多种 Cu - 氧物种；与O2反应则相对较慢。而 4SCC 与两者反应都很缓慢，活性较低，这与 pMMO 中CuB位点的惰性相似，暗示了它们可能存在相似的反应机制。
- ArCuPs 的氧化还原性质：蛋白质膜伏安法测定结果显示，3SCC 和 4SCC 的氧化还原电位（E°）相近，但 4SCC 的循环伏安曲线更宽，表明其电子转移速度较慢，这与之前观察到的反应活性差异相呼应。
- 4SCC 比 3SCC 具有更高的λ值：通过 RDE 和 CA 两种电化学方法，研究人员测定了 ArCuPs 的重组能。结果发现，4SCC 的总重组能（λT）明显高于 3SCC，且其溶剂重组能（λH2O）占比很大。这是因为 4SCC 中存在由 His 和 Glu 形成的氢键，以及由此介导的扩展水分子氢键网络，增加了结构刚性和重组能，从而降低了反应活性。
- 删除氢键相互作用调节λH2O并实现 C-H 氧化：为了验证能否通过改变氢键来调节重组能，研究人员设计了 K6E/E8K-4SCC 突变体，删除了 4SCC 中的 Glu-His 氢键。实验结果表明，突变体的λH2O显著降低，同时恢复了对苄基醇的过氧化活性，证明了通过调节氢键可以调控金属酶的活性。
研究结论和讨论部分指出，通过调节疏水层的 Ile/Ile 到 Leu/Ile 转换，成功调控了 ArCuPs 的寡聚化行为。3SCC 和 4SCC 在还原、再氧化以及催化活性方面存在显著差异，这些差异可归因于内球和外球重组能与结构差异的相互作用。4SCC 中扩展的水分子氢键网络导致其高重组能和低反应活性，而破坏特定氢键能够降低溶剂重组能，使原本无活性的 4SCC 转变为有活性的过氧化催化剂。这一发现为金属酶设计提供了新的策略，即通过精确控制外球溶剂重组能来调节金属酶的活性，有望在生物催化、生物能源等领域得到广泛应用，推动相关领域的发展，为解决实际问题提供新的思路和方法。
