高效并行分析人类细胞中24种Cas12a变体的活性与特异性——为精准基因编辑提供新工具

《自然·通讯》推荐语：针对Cas12a变体选择困难的问题，中国研究团队通过高通量分析系统评估了24种Cas12a变体的PAM兼容性和编辑活性，开发了深度学习模型enDeepCpf1预测编辑效率，并改进GUIDE-seq技术为enGUIDE-seq，揭示了不同变体的脱靶效应和染色体易位特征，为临床基因治疗提供重要参考。

　　

基因编辑技术CRISPR-Cas系统自问世以来彻底改变了生命科学研究格局，其中Cas12a（旧称Cpf1）因其独特的T-rich PAM识别特性、单crRNA引导机制和交错切割模式，在多重基因编辑和临床治疗中展现出独特优势。然而随着工程化改造的深入，科学家们已开发出数十种具有不同PAM兼容性、编辑效率和特异性的Cas12a变体，如enAsCas12a-HF1（扩展靶向范围）、AsCas12a Ultra（高效型）和HyperFi-AsCas12a（高保真型）。面对如此丰富的"基因剪刀库"，研究者们陷入选择困境——如何为特定靶序列快速匹配最优Cas12a变体？传统方法需逐个测试，耗时费力且难以系统评估脱靶风险。更棘手的是，现有GUIDE-seq技术在检测Cas12a诱导的双链断裂时，会因核酸酶持续切割作用导致标记序列（dsODN tag）截断，造成脱靶位点漏检。

为解决这些关键问题，武汉大学的研究团队在《自然·通讯》发表了突破性研究成果。他们建立了包含11,968对向导RNA-靶序列组合的四大文库系统，通过高通量平行分析比较了24种Cas12a变体（涵盖As/Lb/Fn/Eb等天然型及工程改造型）在HEK293T细胞中的编辑效率，绘制出不同PAM序列下的活性图谱。研究还创新性开发了增强版enGUIDE-seq技术，通过优化标记引物设计解决了传统方法的截断问题，并系统评估了各变体的脱靶效应和染色体易位风险。基于海量数据训练的深度学习模型enDeepCpf1，可准确预测不同变体在特定靶点的编辑效率，为精准基因编辑提供智能导航。

关键技术方法包括：1）构建四组靶序列文库（含15类PAM变体）的HEK293T细胞模型；2）多MOI梯度下的Cas12a变体活性高通量筛选；3）卷积神经网络构建的seq-DeepCpf1variants和enDeepCpf1预测模型；4）改进型enGUIDE-seq全基因组脱靶检测；5）Western blot验证蛋白表达一致性。

研究结果精要

高通量评估24种Cas12a变体活性

通过标准化文库系统发现：对于经典TTTV PAM，突变体mut2C-W编辑效率最高（74.5%），而CeCas12a仅识别TTTV且活性中等（55.5%）。扩展型变体表现突出——enAsCas12a-HF1可识别全部15种PAM，LbCas12aRVRR兼容14种PAM。有趣的是，5'端核苷酸显著影响活性，如AsCas12a变体对C起始的CTCV PAM效率比A/G/T起始高3倍。

PAM兼容性全景图谱

首次系统绘制各变体的PAM偏好：enEbCas12a在CTCV/GTTV等PAM下效率达54.3%，而LbCas12aRR对CCCVPAM展现超强活性（64%）。工程化变体突破天然限制——AsCas12aRVR可高效编辑TATVPAM（53%），FnCas12aRVR将识别范围扩展至TATM。

深度学习模型精准预测

开发的seq-DeepCpf1variants模型在测试集表现优异（Pearson r=0.86），整合染色质可及性信息的enDeepCpf1进一步提升预测精度，在独立验证集中相关系数达0.83，显著优于现有工具DeepGuide和CRISPR-DT。

enGUIDE-seq揭示安全性特征

改进技术使标记序列检出率提升5倍。保真型变体HyperFi-AsCas12a特异性评分最高（0.7），而高效型HyperLbCas12a仅0.14。出乎意料的是，染色体易位频率与活性/特异性无显著相关性，提示易位机制复杂。

研究意义与展望

这项研究构建了迄今为止最全面的Cas12a变体"性能数据库"，其创新性体现在三个方面：技术层面，enGUIDE-seq解决了Cas12a脱靶检测的技术瓶颈；理论层面，揭示了不同结构域改造（如WED-II区突变）对PAM兼容性的调控规律；应用层面，开发的预测模型可快速匹配"最佳变体-靶点"组合。对于遗传病治疗，研究提示选择LbCas12a K538R等变体可平衡效率与安全性；而需要多重编辑时，enAsCas12a-HF1的广谱PAM识别能力更具优势。未来，该团队计划将平台扩展至原代细胞和动物模型，进一步推动Cas12a变体在基因治疗中的精准应用。