敏感模块化扩增子测序技术：揭示恶性疟原虫多样性及耐药性的研究利器

《Scientific Reports》：Sensitive and modular amplicon sequencing of Plasmodium falciparum diversity and resistance for research and public health

编辑推荐：为解决疟疾防控中基因组监测工具的多功能性和灵敏度不足问题，美国加州大学旧金山分校等团队开发了MAD4HatTeR扩增子测序技术。该技术靶向165个高多样性位点和118个耐药/疫苗靶点，可检测低至1%的次要等位基因频率和基因拷贝数变异，并在非洲多国实验室验证了其可重复性，为疟疾研究和公共卫生决策提供了高效工具。

　　疟疾是全球重大公共卫生问题，恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的基因组多样性监测对防控至关重要。然而，传统方法如长度多态性和微卫星分型灵敏度低，而全基因组测序（WGS）成本高昂且难以捕获低密度样本的变异。现有扩增子测序技术或靶标单一（如SpotMalaria仅检测100个SNP），或地理适用性有限（如Pf AmpliSeq针对秘鲁种群）。如何开发兼具高灵敏度、多靶点覆盖和跨实验室可重复性的工具，成为亟待解决的挑战。

针对这一需求，加州大学旧金山分校EPPIcenter的Andrés Aranda-Diaz团队联合非洲多国研究机构，在《Scientific Reports》发表了MAD4HatTeR技术。该研究通过整合165个高多样性微单倍型（microhaplotype）和118个耐药/疫苗靶点（如kelch13、hrp2/3），建立了两模块化扩增子测序体系，结合优化的生物信息学流程，实现了从干血斑（DBS）甚至蚊媒中肠样本中检测低至1%的次要等位基因频率（WSAF），并首次通过扩增子数据可靠识别基因拷贝数变异。

关键技术包括：1) 基于全球WGS数据筛选150-300 bp高变异区间，避开串联重复区域设计引物；2) 使用CleanPlex多重PCR技术同步扩增多样性模块（D1）和耐药模块（R1.2/R2）；3) 开发Nextflow生物信息流程，通过DADA2算法去噪和样本伪池化处理提升低频变异检测精度；4) 采用广义加性模型校正扩增子长度偏差，定量hrp2/3缺失和mdr1重复。样本来源涵盖实验室培养株混合体、埃塞俄比亚/莫桑比克现场样本及乌干达蚊媒中肠。

研究结果：

1. ?MAD4HatTeR利用恶性疟原虫遗传多样性
   165个多样性靶点中140个为微单倍型，中位含3个SNP（IQR 2-5），非洲样本杂合度>0.5的靶点达132个。模拟显示其对多克隆感染（COI=5）中半同胞寄生虫（IBD=1/4）的检测效能达73%，优于同类技术。

2. ?适应多样本类型及低密度检测
   在>10寄生虫/μL的DBS中，95%靶点覆盖深度>100×；蚊媒中肠样本（0.9寄生虫/μL等效浓度）仍可恢复84%靶点。五国实验室数据重现性验证显示等位基因频率相关性R²>0.99。

3. ?精准识别低频变异与耐药标记
   在>1,000寄生虫/μL样本中可检出≥2% WSAF（灵敏度>95%），假阳性率<0.7%（过滤阈值5%）。耐药模块覆盖kelch13（C580Y）、dhfr（S108N）等15个基因关键位点，与预期突变频率高度吻合（R²=0.99）。

4. ?拷贝数变异及非恶性疟原虫检测
   广义加性模型准确识别hrp2缺失（AUC=1.0）和mdr1重复（与qPCR结果相关性R²=0.89）。非恶性疟原虫ldh靶标在P. vivax/P. ovale混合感染中灵敏度达96%（>100 18S拷贝/μL）。

结论与意义：
MAD4HatTeR首次将高分辨率微单倍型分型、多药耐药监测和跨物种检测整合于单一技术平台。其模块化设计（如单独使用D1模块进行传播动力学研究）显著提升资源利用效率。在非洲三国的成功实施证明该技术适用于资源有限地区，为疟疾消除中的精准监测提供关键工具：例如通过hrp2缺失监测快速诊断试剂的失效风险，或利用微单倍型区分输入性与本地传播链。未来可通过纳入CSP重复区等靶点进一步扩展应用场景。