基于人多能干细胞衍生肝类器官多因素分析的肝毒性评估新方法：开启药物研发新征程

《Scientific Reports》：Hepatotoxicity evaluation method through multiple-factor analysis using human pluripotent stem cell derived hepatic organoids

在药物研发中，预测药物性肝损伤（DILI）意义重大。韩国研究人员开发出基于肝类器官（HOs）和功能终点的方法，通过多因素分析评估肝毒性。结果显示该方法能有效预测 DILI，为早期药物研发提供了可靠的肝毒性评估手段。

　　在药物研发的漫漫征途中，药物性肝损伤（Drug-induced liver injury，DILI）宛如一只 “拦路虎”。据了解，约 20% 已开发的药物因 DILI 问题被撤出市场，这不仅让大量的研发投入付诸东流，还可能延误疾病治疗，危害患者健康。而且，非临床和临床研究中 DILI 相关结果差异显著，在药物研发早期预测其肝毒性迫在眉睫。

以往的预测手段各有缺陷。体外细胞模型中，肝源性细胞系如 HepG2、HepaRG 和 Huh 等虽在早期研发中有所应用，但与人体组织相比，其肝功能和药物代谢酶活性较低，难以反映药物在体内复杂的代谢效应；原代人肝细胞（Primary human hepatocytes，PHHs）虽为评估药物代谢和毒性的金标准体外模型，却存在寿命短、供体差异大、成本高等问题。动物模型在药物研发后期用于评估肝毒性，然而由于 CYP 介导的药物代谢存在显著的种间差异，无法精准模拟人体对药物的代谢反应，同时还面临伦理困境。

为攻克这些难题，韩国研究机构的研究人员开展了一项意义非凡的研究。他们旨在开发一种基于 HOs 和功能终点的方法，精准预测 DILI 。研究人员将人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）衍生的 HOs 与肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）和 THP-1 巨噬细胞在基质胶穹顶中共培养，模拟人体肝脏的细胞和生理环境。

该研究成果意义重大，其建立的肝毒性评估方法在早期药物研发中具有良好的应用前景，有助于降低药物因肝毒性问题而被撤市的风险，为新药研发保驾护航。此研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员开展研究时用到的主要关键技术方法如下：首先是细胞培养技术，包括 HOs、THP-1 巨噬细胞和 HSCs 的培养，以及它们的共培养；其次是多种指标的检测技术，如利用 DCFDA - based assay 测量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，使用 ELISA 试剂盒检测细胞因子水平，采用相应的检测试剂盒测定肝酶活性和白蛋白水平等；最后是数据处理和分析技术，通过绘制雷达图、计算多边形相对面积来分析药物对不同肝毒性相关因素的影响。

下面介绍研究结果：

1. HO 单培养与 HO/HHSteC/THP - 1 共培养的比较：通过实时 PCR 检测发现，HO/HSC/THP - 1 共培养中，大部分肝功能相关基因（如 ALB、AAT 和部分 CYP 酶）的 mRNA 水平显著高于单培养。在共培养中，CYP1A2、CYP3A4 和白蛋白水平分别增加了 3.8 倍、5.5 倍和 5 倍。同时，共培养中与氧化应激相关的因子 GSSG 和过氧化氢酶（catalase）活性分别显著降低和升高，IL - 6 和 IL - 10 水平也显著增加 ，表明炎症相关因子在共培养的 THP - 1 细胞中发挥了作用。
2. 线粒体功能和细胞活力：研究人员用 12 种化合物处理共培养的 HO/HSC/THP - 1 细胞，分析线粒体功能和细胞活力。结果显示，仅胺碘酮（Amiodarone，AMIO）显著降低线粒体功能，且对细胞活力抑制约 80%。其他化合物中，部分虽对线粒体活性和细胞活力有影响，但两者之间相关性较弱，表明不能仅依据线粒体毒性或细胞活力抑制来预测药物肝毒性。
3. 氧化应激相关因子水平：处理 9 小时后，所有化合物均使 ROS 水平比对照组显著增加两倍以上。不同化合物对过氧化氢酶活性的抑制程度不同，严重 DILI 组的部分化合物（如 KET、NEF 和 TZ）显著改变 ROS 水平。此外，GSSG 水平也因化合物不同而有显著差异，严重组尤为明显。通过雷达图分析发现，严重组化合物的相对多边形面积显著大于无 DILI 组和高 DILI 组，说明与 DILI 相关的药物与氧化应激有关，可基于氧化应激相关参数预测其毒性。
4. 炎症细胞因子水平：12 种肝毒性化合物处理后，与对照组相比，IL - 1β、IL - 6 和 IL - 10 水平均升高，其中 IMI、KET、NET 和 TZ 的作用尤为显著。严重 DILI 组的部分药物使 IL - 6 和 IL - 10 水平显著增加。雷达图显示，严重 DILI 组药物形成的多边形向 IL - 1β 和 IL - 10 倾斜，且其多边形面积显著大于无 DILI 组和轻度 DILI 组，表明分析这些炎症因子有助于识别可能导致严重 DILI 的药物。
5. 肝功能标志物水平：在轻度和严重 DILI 组中，肝毒性化合物显著增加 ALT 活性，在严重 DILI 组中，部分化合物（如 AMIO、KET 和 NEF）显著增加 AST 活性。在白蛋白水平方面，无 DILI 组的化合物无显著影响，而轻度 DILI 组的 IMI 和严重 DILI 组的 AMIO、NEF 显著降低白蛋白水平。雷达图和多边形面积测量结果表明，肝毒性化合物显著改变肝功能标志物水平，可用于评估肝毒性。
6. 肝毒性预测：研究人员绘制了肝毒性化合物对氧化应激、免疫相关因子和肝功能标志物影响的多边形图。结果显示，大多数化合物增加了氧化应激相关因子水平，轻度和严重 DILI 组化合物的多边形面积比无 DILI 组大两倍以上，且严重 DILI 组化合物的多边形面积显著大于无 DILI 组和轻度 DILI 组，这与氧化应激、炎症和肝功能相关因子的结果一致，表明该多因素肝毒性预测方法具有预测肝毒性的潜力。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，开发准确预测潜在药物肝毒性的方法对药物研发至关重要，可降低成本，避免药物因肝毒性撤市。他们开发的基于 hPSCs 衍生 HOs 的系统虽有一定优势，但也存在局限性。例如，缺乏肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）和胆管上皮细胞，限制了对体内肝脏微环境的完全模拟；HOs 的代谢活性和酶表达与原代肝细胞不完全匹配；HSCs 和 THP - 1 巨噬细胞的激活状态不能完全反映肝纤维化和炎症的动态进展；实验的短期性可能无法捕捉慢性肝毒性或延迟毒性反应；hPSCs 衍生肝细胞的供体间差异和类器官分化的批次间差异也影响了模型的可重复性和预测准确性。

尽管存在这些不足，该共培养模型仍为炎症驱动的肝损伤研究提供了有价值的见解。未来研究可通过纳入更多肝细胞类型、优化分化方案、延长实验时间以及结合直接酶活性检测等方式，进一步优化该模型，增强其可靠性和预测能力。此外，整合全球 DILI 登记处的数据与该模型，有望提高其预测准确性和临床相关性。总之，这项研究为药物研发中肝毒性评估提供了新的思路和方法，对推动新药研发进程具有重要意义。