磷酸化与Ca2+调控人磷酸化酶激酶（PhK）的分子机制及其在糖原贮积症IX型和肿瘤中的意义

编辑推荐：本研究通过冷冻电镜（cryo-EM）和交联质谱（XL-MS）技术，解析了人肌肉磷酸化酶激酶（PhK）在失活与激活状态下的近原子结构，揭示了磷酸化修饰和Ca2+协同调控PhK活性的分子机制，阐明了其与底物糖原磷酸化酶（GP）的结合模式，为糖原贮积症IX型（GSD IX）和肿瘤治疗提供了新靶点。

　　糖原是动物体内葡萄糖的主要储存形式，其代谢紊乱与多种疾病密切相关。磷酸化酶激酶（PhK）作为糖原降解级联反应的核心调控者，通过磷酸化糖原磷酸化酶（GP）激活糖原分解。然而，PhK突变会导致糖原贮积症IX型（GSD IX），表现为肝肿大、肌无力等症状；其异常表达还与肿瘤生长迁移相关。尽管PhK是首个被发现的蛋白激酶，但其庞大复杂的结构使得调控机制长期未被阐明。

为揭示PhK的分子调控机制，中国科学院的研究团队通过重组表达获得了全长人肌肉PhK（hPhK），利用冷冻电镜解析了其失活（去磷酸化无Ca²⁺）和激活（磷酸化含Ca²⁺）状态的结构（分辨率分别为4.2?和3.7?），并结合交联质谱分析了PhK与GP的相互作用。研究采用HEK293F细胞表达系统制备蛋白，通过λ-磷酸酶（Lambda-PP）和蛋白激酶A（PKA）分别处理获得不同磷酸化状态样本，使用抗Flag亲和树脂纯化复合物，并开展激酶活性检测。

结构分析显示，PhK是由(αβγδ)₄组成的十六聚体，β亚基构成中心支架，γδ亚基位于边缘。在失活状态下，γ亚基的自抑制域（AID）占据底物结合位点，而δ亚基（钙调蛋白CaM）以非典型紧凑构象结合γ亚基。磷酸化诱导β亚基的Ser27和Ser701位点构象变化，使β₄同源四聚体中心距离缩短7.1?，带动α亚基移动并解除对γ亚基激酶域（CKD）的抑制。Ca²⁺则促使CaM沿γ-CBD螺旋滑动，减弱与γ-C lobe的相互作用。这两种调控方式协同作用，使γ-CKD发生振动翻转（通过正态模式分析证实），暴露催化中心。交联质谱进一步揭示：在失活状态下，GP主要与α/β亚基结合；激活后，GP还能与γ亚基的Lys143交联，提示磷酸化/Ca²⁺促使GP从预结合状态转向催化位点。

研究还对比了碱性pH（8.2）的激活效果，发现其构象变化比磷酸化更显著，可能通过维持γ-CKD的持续解离增强活性。这些发现不仅阐明了PhK"双锁"调控机制（磷酸化与Ca²⁺分别解除α/β和δ亚基对γ亚基的抑制），还解释了GSD IX致病突变可能破坏的关键相互作用界面。此外，PhK在肿瘤中59-97%的突变率及其对能量代谢的调控，使其成为潜在的肿瘤治疗靶点。

该研究发表于《Nature Communications》，首次完整呈现了PhK在不同功能状态下的结构动态变化，为理解糖原代谢调控提供了原子水平的框架，并为相关疾病的药物设计奠定了结构基础。Ruifang Ma、Bowen Du等作者的工作不仅解决了这一经典激酶长达70年的机制谜题，更开辟了通过靶向PhK调控网络治疗代谢疾病和肿瘤的新途径。