细菌蛋白酶体激活因子Bpa不对称结合底物的结构机制及其在结核分枝杆菌应激调控中的作用

编辑推荐：本研究通过冷冻电镜技术解析了结核分枝杆菌蛋白酶体激活因子Bpa与天然底物HspR的复合物结构（4.1?），揭示了Bpa通过不对称结合方式招募底物的分子机制。研究人员发现Bpa通过其螺旋H4延伸段的H131、F138和R145残基与HspR的DNA结合域相互作用，并证实这些位点突变会显著抑制底物降解。该研究为理解细菌ATP非依赖型蛋白酶体降解系统的底物识别提供了结构基础，对开发针对结核病等病原体的新型抗菌策略具有重要意义。

　　 在细菌的生存策略中，蛋白质质量控制是应对环境变化的核心机制。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）作为人类顽敌，其持久感染能力依赖于一种独特的蛋白酶体系统——通过水平基因转移从放线菌中获得的20S核心颗粒（20S CP）与环形激活因子复合物协同作用。其中，细菌蛋白酶体激活因子Bpa（Bacterial proteasome activator）能以ATP非依赖方式降解热休克抑制蛋白HspR等底物，帮助病原体在宿主巨噬细胞内存活。然而，Bpa如何特异性识别底物并启动降解的分子机制长期未明，这限制了针对该通路的抗菌药物开发。

为破解这一难题，苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）的Tatjana von Rosen团队联合多国研究人员，通过冷冻电镜（cryo-EM）首次解析了全长Bpa与天然底物HspR的复合物结构，并结合生化实验揭示了底物识别关键残基。该成果发表于《Nature Communications》，为细菌应激调控提供了新见解。

研究采用梯度固定（GraFix）技术稳定Bpa-20S CP复合物，结合冷冻电镜三维重构（3.3?全局分辨率）发现：Bpa十二聚体通过7个连续亚基的C端GQYL基序不对称锚定在20S CP的α环上，形成"铰链盖"构象。针对Bpa_36-139-HspR_ΔC9复合物的4.1?结构显示，底物密度集中于Bpa腔内H131残基附近，交联质谱（XL-MS）证实HspR的N/C端柔性区与Bpa内壁K55形成共价连接。关键的是，突变实验证实H131、F138和R145构成底物结合热点——三者同时突变使HspR降解效率降至野生型的25%，荧光结合实验显示这些残基显著影响Bpa与HspR的亲和力。

研究结果部分：

1. ?Bpa不对称结合蛋白酶体并占据所有锚定位点：冷冻电镜显示Bpa十二聚体倾斜结合20S CP，7个GQYL基序完全占据α亚基结合口袋，未结合的5个亚基形成动态游离端。
2. ?全长Bpa的构象动态性：未结合状态的Bpa冷冻电镜结构（3.2?）揭示其N/C端具有显著柔性，H4螺旋仅稳定至Q140残基，为底物识别提供结构可塑性。
3. ?底物结合腔的残基功能验证：H131S/F138S/R145S三重突变体使HspR降解效率降低80%，证实这些残基通过芳香环堆叠（H131/F138）和静电作用（R145）协同介导底物招募。

结论与意义： 该研究首次阐明Bpa通过"不对称铰链"机制实现底物选择与蛋白酶体激活的双重功能。结构动态分析表明，Bpa的构象变化可能促进底物去折叠，而H131/F138/R145构成的结合腔为开发特异性抑制剂提供了靶点。鉴于结核分枝杆菌依赖Bpa-HspR通路抵抗宿主应激，针对该互作界面的药物设计有望阻断病原体持久感染。此外，Bpa与真核生物PA28/PA200激活因子的功能类比，为理解ATP非依赖型蛋白酶体系统的进化提供了新视角。