(p) ppGpp 介导的 GTP 稳态：金黄色葡萄球菌生存与抗生素耐受性的关键密码

《Communications Biology》：(p)ppGpp-mediated GTP homeostasis ensures survival and antibiotic tolerance of Staphylococcus aureus

在抗生素治疗失败问题中，非生长细菌群体的抗生素耐受性备受关注，(p) ppGpp 在其中的作用存在争议。研究人员针对金黄色葡萄球菌展开研究，发现 (p) ppGpp 依赖的 GTP 池限制对饥饿细胞的可培养性至关重要，靶向 PMF 或核苷酸可用性有望对抗抗生素耐受性。

　　在细菌的奇妙世界里，它们如同拥有超能力的小生命，能根据环境变化自如切换生长模式。当营养充足时，它们迅速繁殖；而在营养受限的情况下，便进入一种非生长但抗逆性强的状态。这种非生长状态的细菌，往往与持续性感染和抗生素耐受性紧密相关，让医生们头疼不已。就像金黄色葡萄球菌，作为一种常见的人类病原体，它在非生长状态下对多种抗生素产生耐受性，使得感染难以治愈。长期以来，科学家们一直在探索其中的奥秘，而信使分子 (p) ppGpp 在这一过程中的作用充满争议，成为研究的焦点。为了揭开这层神秘的面纱，来自德国图宾根大学跨学科微生物学与感染医学研究所、图宾根大学 “控制微生物以对抗感染” 卓越集群（Cluster of Excellence EXC 2124 “Controlling Microbes to Fight Infections”）的研究人员 Andrea Salzer、Sophia Ingrassia、Parvati Iyer 等展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》上，为我们理解金黄色葡萄球菌的生存机制和对抗抗生素耐受性提供了新的思路。

研究人员运用了多种关键技术方法。在菌株构建方面，通过特定的诱变策略构建了多种金黄色葡萄球菌突变株，如 SH1000 (p) ppGpp⁰、guaBA 缺失突变株等；在基因表达分析上，采用 RNA 测序（RNAseq）和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术，来探究不同条件下基因表达的变化；利用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术对代谢物进行提取和定量分析，以了解核苷酸水平的变化；借助多种染色和检测技术，像 LIVE/DEAD 染色、RedoxSensor Green assay、AlamarBlue measurement 等，对细菌的生存状态、代谢活性等进行评估 。

研究结果如下：

1. (p) ppGpp 对稳定期可培养性的贡献：研究人员监测了金黄色葡萄球菌野生型菌株 HG001 及其 (p) ppGpp 突变株在化学限定培养基（CDM）中的生长和可培养性。结果显示，野生型和突变株在光密度（OD₆₀₀）测量的生长方面无显著差异，但进入稳定期后，突变株的菌落形成单位（CFU）数量开始下降，而野生型则保持相对稳定。这表明 (p) ppGpp 对细菌在稳定期的可培养性至关重要，同时在指数生长期应对诱导应激条件时也发挥着重要作用。
2. (p) ppGpp 依赖的 GTP 稳态对稳定期可培养性的影响：已知 (p) ppGpp 的合成会导致 GTP 池减少，研究人员通过改变 GTP 合成途径相关基因，如删除 codY 基因、guaBA 基因等，探究 GTP 水平变化对细菌生存的影响。结果发现，删除 guaBA 基因可挽救 (p) ppGpp 突变株的生存缺陷，而补充鸟嘌呤会导致 (p) ppGpp 突变株可培养性呈剂量依赖性下降。这证实了 GTP 水平和 GTP/ATP 比值的改变与菌株的生存表型高度相关，且这种影响并非由 GTP 依赖的阻遏蛋白 CodY 介导。
3. (p) ppGpp 缺陷细胞在饥饿期间的状态：尽管 (p) ppGpp 突变株在稳定期 CFU 数量大幅下降，但用膜不渗透染料碘化丙啶染色的细胞比例却很少，且与野生型无显著差异。同时，突变株的代谢活性虽有下降，但幅度小于 CFU 数量差异所预期的。这表明 (p) ppGpp 缺陷细胞并未立即丧失活力，而是进入了一种休眠状态，减缓代谢活动并停止细胞分裂，从而导致 CFU 数量大幅下降。
4. (p) ppGpp 突变株进入休眠状态的相关因素：虽然 (p) ppGpp 突变株在指数生长后期和稳定期早期翻译水平显著升高，但在稳定期后期翻译完全停止。用氯霉素抑制翻译并不能提高 (p) ppGpp 细胞的可培养性，说明翻译抑制延迟导致的蛋白质聚集增加并非 (p) ppGpp 细胞在稳定期饥饿时不可培养的原因。此外，(p) ppGpp 缺陷细胞的不可培养性仅在有氧条件下出现，与氧化应激无关。
5. (p) ppGpp 细胞的膜功能和结构变化：在稳定期，(p) ppGpp 突变株的膜电位显著低于野生型，且细胞膜出现不规则染色和流动性增加的现象，而细胞壁则无明显异常。这表明高 GTP 水平会干扰膜电位，导致细胞膜结构和流动性改变，进而影响细菌的可培养性。
6. (p) ppGpp 生物合成和 GTP 失衡对转录组的影响：通过 RNAseq 分析，研究人员发现 (p) ppGpp 突变株与野生型相比，有 115 个基因显著上调，115 个基因显著下调。其中，许多 CodY 靶基因下调，而参与电子传递链的基因表达发生明显改变。高 GTP 水平导致电子传递链相关基因如 qoxABCD 等下调，进而影响电子传递链活性和质子动力势（PMF）。
7. qoxABCD 表达对电子传递链和 PMF 的重要性：研究人员通过定点突变 qoxABCD 启动子区域的转录起始核苷酸（iNTP），将预测的起始核苷酸 ATP 突变为 GTP，结果使 (p) ppGpp 突变株中 qoxA 表达增加，CFU 数量也有所增加，但仍低于野生型。这表明 qoxABCD 表达的敏感性对电子传递链活性和 PMF 至关重要，维持 PMF 对稳定期细菌的可培养性至关重要。
8. PMF 对稳定期抗生素耐受性的影响：研究人员用亚抑制浓度的缬氨霉素处理野生型和 (p) ppGpp 突变株，发现处理后两者 CFU 数量均显著下降，说明破坏膜电位会损害细菌的可培养性和生存能力。同时，(p) ppGpp 突变株在稳定期对 β- 内酰胺类抗生素（如苯唑西林）、氟喹诺酮类抗生素（如环丙沙星）和氨基糖苷类抗生素（如庆大霉素）的耐受性明显降低，而野生型非生长细菌则具有较高的抗生素耐受性。这表明维持 PMF 对稳定期细菌的抗生素耐受性至关重要。

研究结论和讨论部分指出，细菌在稳定期的可培养性依赖于 (p) ppGpp 驱动的 GTP 消耗。(p) ppGpp 突变株中不受控制的高 GTP 水平会导致膜紊乱和 PMF 降低，而较低的 PMF 至少部分与呼吸链中核苷酸敏感基因的转录下调有关。在 (p) ppGpp 存在且 GTP 水平较低的条件下，维持呼吸链活性可能是稳定期细胞对杀菌性抗生素具有耐受性的原因。此外，研究还发现 (p) ppGpp 缺陷导致的 GTP 失衡会使金黄色葡萄球菌进入一种非可培养但存活（VBNC）的状态，这可能与 PMF 降低、细胞膜变化等因素有关。而且，(p) ppGpp 对细菌生存的影响在有氧和无氧条件下存在差异，在有氧条件下 (p) ppGpp 对维持 PMF 至关重要，而无氧条件下细菌的生存不依赖于 (p) ppGpp。这些研究结果为深入理解金黄色葡萄球菌的生存机制和抗生素耐受性提供了重要依据，也为开发新的抗菌策略提供了潜在的靶点，有望通过靶向 PMF 或核苷酸可用性来对抗抗生素耐受性，为解决临床上的细菌感染问题带来新的希望。