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为解决 β- 血红蛋白病治疗靶点局限问题，研究人员开展了关于 HBG2远端启动子编辑的研究。他们发现插入核苷酸 A（insA）可显著提升 γ- 珠蛋白表达，且无脱靶效应，为 β- 血红蛋白病治疗提供了新靶点与策略。
地中海贫血，这个名字听起来或许有些陌生，但它却给无数患者带来了痛苦。作为一种常见的遗传性血液疾病，β- 地中海贫血患者的血红蛋白合成出现异常，导致贫血、发育迟缓等一系列严重症状，严重影响生活质量和寿命。目前，针对 β- 地中海贫血的治疗策略主要聚焦于重新激活 γ- 珠蛋白（HbF）的表达，然而现有治疗靶点多集中在近端启动子区域，不仅容易引发基因大片段缺失，编辑效率也有待提高，这让众多患者依旧在病痛中苦苦挣扎。
在这样的背景下，广东妇女儿童医院、南方医科大学等机构的研究人员挺身而出，决心探索新的治疗靶点，为患者带来新的希望。他们开展了一项极具创新性的研究，利用 CRISPR/Cas9 系统对 HBG2远端启动子进行编辑。经过一系列复杂而严谨的实验，研究人员发现了一个令人振奋的结果：在 HBG2转录起始位点（TSS）上游 - 1368 和 - 1369bp 之间插入核苷酸 A（insA），能够显著提高 γ- 珠蛋白的表达水平。这一发现意义重大，为 β- 地中海贫血的治疗提供了全新的靶点和策略，有望改善患者的症状，提高他们的生活质量。该研究成果发表在《Experimental Hematology & Oncology》杂志上。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，从健康供体和 β- 地中海贫血患者的外周血中获取 CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs），并进行细胞培养与分化；运用 CRISPR/Cas9 技术对 HBG2远端启动子进行编辑，通过克隆培养筛选编辑后的细胞。在检测分析方面，利用 qPCR 检测 γ- 珠蛋白 RNA 表达水平，HPLC 检测 HbF 和 HbA 水平，还有 Western blot、ATAC-seq、ChIP 等技术探究 insA 影响 γ- 珠蛋白表达的机制。此外，通过构建移植小鼠模型，将编辑后的人 CD34+HSPCs 移植到免疫缺陷小鼠体内，评估 insA 对 γ- 珠蛋白表达的体内影响。
下面来看具体的研究结果：
- insA 激活 HbF：研究人员利用公开数据和 CRISPR/Cas9 技术编辑 HUDEP-2 细胞的 HBG2远端启动子，发现了 insA 突变，该突变能使 γ- 珠蛋白表达显著增加。
- insA 提升 γ- 珠蛋白表达：在 HUDEP-2 细胞中，转导 CRISPR/Cas9 和 sgRNA 后，insA 突变频率高，γ- 珠蛋白 mRNA 及蛋白水平大幅上升；在健康个体的 CD34+HSPCs 中，优化编辑效率后，引入 insA 也显著提升了 γ- 珠蛋白相关指标，且不影响细胞活性和增殖。
- insA 对 β- 地中海贫血患者的治疗作用：对不同基因型的 β- 地中海贫血患者的 CD34+HSPCs 进行编辑，发现 insA 能强力诱导 γ- 珠蛋白表达，提高细胞活力，减少细胞凋亡。
- insA 在移植小鼠中的作用：将编辑后的人 CD34+HSPCs 移植到免疫缺陷小鼠体内，发现小鼠骨髓中 γ- 珠蛋白显著诱导，且编辑后的骨髓细胞可支持二次移植，维持较高的 indel 频率。
- insA 对红细胞分化和脱靶效应的影响：检测编辑后的 HUDEP-2 细胞和 CD34+HSPCs 的表面标记，发现 insA 不阻碍健康供体红细胞分化，还改善了 β- 地中海贫血患者的终末红细胞分化；同时，深度测序和 MLPA 检测表明 insA 无显著脱靶效应。
- insA 与 FOXO3 的关系：RNAseq 和相关实验表明，insA 突变创建了激活因子 FOXO3 的结合位点，激活了 FOXO3 和 AMPK，影响了组蛋白修饰模式。
- insA 对染色质状态和甲基化的影响：ATAC-seq 和 ChIP-seq 等实验显示，insA 激活了染色质状态，增加了活性修饰标记，降低了 - 162 CpG 位点的甲基化水平，减少了 DNMT3A、BCL11A 和 ZBTB7A 的富集。
- 多重诱变的效果：对 HUDEP-2 细胞进行 insA 和近端 HPFH 突变位点的多重诱变，发现可协同提升 γ- 珠蛋白 mRNA 水平，且多数情况下不会导致位点间的缺失。
研究结论和讨论部分指出，insA 突变位于 HBG 远端启动子，无脱靶效应，能显著提升 γ- 珠蛋白表达，编辑效率高，不影响红细胞分化和其他已知红细胞修饰因子，还激活了染色质状态。将 insA 与 - 162 CpG 位点去甲基化或近端 HPFH 突变位点编辑相结合，可能进一步提高治疗指数。然而，insA 激活 γ- 珠蛋白表达的潜在机制尚未完全明确，如 insA 影响 FOXO3 激活的具体方式，以及 FOXO3 与染色质修饰的关系等，仍需进一步研究。尽管如此，这项研究为 β- 血红蛋白病的基因治疗提供了一个极具前景的靶点，为未来的临床治疗带来了新的希望，有望推动 β- 地中海贫血治疗领域的重大变革，让更多患者摆脱病痛的折磨。
