揭示微卫星不稳定型胃腺癌的潜在调控因子 TNFSF9：肿瘤微环境的新洞察

《European Journal of Medical Research》：Integrative analysis of bulk and single-cell sequencing reveals TNFSF9 as a potential regulator in microsatellite instability stomach adenocarcinoma

为探究微卫星不稳定（MSI）与非 MSI 胃腺癌（STAD）肿瘤微环境（TME）的差异及潜在机制，研究人员整合单细胞和 bulk 测序开展研究。结果发现 MSI 与更好预后相关，TNFSF9 在 MSI 中高表达，该研究为 STAD 治疗提供新方向。

　　胃癌，这个在全球范围内严重威胁人类健康的 “杀手”，一直是医学研究的重点对象。在众多胃癌类型中，胃腺癌（Stomach adenocarcinoma，STAD）占据了相当大的比例。根据分子表型，STAD 又可细分为多种亚型，其中微卫星不稳定（Microsatellite instability，MSI）型 STAD 因其独特的生物学特性和较好的预后，引起了科研人员的广泛关注。然而，尽管此前的研究已经发现 MSI 型 STAD 与更好的预后相关，并且在接受免疫检查点抑制剂治疗时表现出更好的效果，但对于 MSI 与非 MSI 型 STAD 在肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）方面的差异，以及背后的潜在机制，人们了解得还十分有限。此前研究使用的 bulk RNA 测序技术，在捕捉不同细胞类型之间的相互作用时存在局限性，也未能深入探究免疫浸润差异的分子机制。为了填补这些知识空白，来自广东省人民医院（Guangdong Provincial People’s Hospital）、南方医科大学、华南理工大学医学院等机构的研究人员，开展了一项极具意义的研究。该研究成果发表在《European Journal of Medical Research》上，为深入理解 MSI 型 STAD 的生物学特性和治疗策略提供了重要依据。

研究人员在本次研究中，运用了多种关键技术方法。首先，研究数据来源于多个公共数据库，如 GSE183904 数据集的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据、GSE62254 数据集的 bulk RNA 测序数据，同时还使用了 TCGA 数据库评估 TNFSF9 的表达差异。研究样本则取自广东省人民医院的 23 例 STAD 病理切片。在分析过程中，利用 “CIBERSORT” 算法计算免疫浸润细胞比例，通过 Seurat 包和 “CellChat” 等工具对单细胞数据进行处理和细胞间通讯分析，还运用 R 包 “Limma” 进行差异表达基因（DEGs）分析，通过免疫组化（IHC）、定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质免疫印迹（WB）对关键基因 TNFSF9 进行验证。

研究结果主要体现在以下几个方面：

1. MSI 与更好的生存相关：通过对 GSE62254 数据集的 bulk RNA 测序数据进行生存分析，发现 MSI 型 STAD 患者的预后明显更好。无论是未调整协变量的 Cox 回归分析，还是调整协变量后的分析结果，都证实了这一关联。这表明 MSI 是影响 STAD 患者预后和生存的重要因素。
2. TME 的异质性：在 bulk RNA 测序分析中，虽然 MSI 与非 MSI 型 STAD 在免疫评分、基质评分和肿瘤纯度评分方面没有显著差异，但进一步分析 22 种免疫浸润细胞发现，MSI 型中 CD4 记忆激活 T 细胞和 M1 巨噬细胞的丰度更高，而 CD4 记忆静止 T 细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞的丰度较低。在单细胞 RNA 测序分析中，研究人员对 TME 的单细胞水平异质性进行了深入探究。结果显示，MSI 型中 T&NK 细胞的比例更高，而浆细胞和成纤维细胞在非 MSI 型中更为丰富。在淋巴细胞亚群分析中，MSI 型中 NK 细胞、调节性 CD4⁺T 细胞和 Th1 样 CD4⁺T 细胞的丰度增加，而 CD4⁺T 细胞、效应记忆 CD8⁺T 细胞在非 MSI 型中更丰富。在髓细胞亚群分析中，MSI 型中树突状细胞（DCs）、单核细胞和 M1 巨噬细胞的丰度更高，而巨噬细胞在非 MSI 型中占主导地位，且 MSI 型中活化 DCs 和 cDC1s 显著富集。
3. MSI 的 TME 中细胞因子相关通路：通过筛选 bulk RNA 测序数据中的差异表达基因，研究人员发现 MSI 型中细胞因子 - 细胞因子受体相互作用通路显著富集。基因集富集分析（GSEA）、基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析均证实了这一点。此外，“CellChat” 包的分析显示，CXC 趋化因子配体（CXCL）通路在 MSI 型中的信息流更高。
4. TNFSF9 在 MSI 的 TME 中的重要作用：研究人员通过分析细胞因子相关通路中的重叠基因，确定了 8 个关键枢纽基因，其中 TNFSF9 在 MSI 型中表达显著更高。无论是在公共数据库分析，还是在单细胞分析、IHC、qPCR 和 WB 实验中，都验证了这一结果。进一步的相关性分析表明，TNFSF9 的表达与 M1 巨噬细胞的丰度呈正相关。

在研究结论和讨论部分，该研究揭示了 MSI 和非 MSI 型 STAD 在 TME 方面存在显著差异。MSI 型中抗原呈递细胞（如 M1 巨噬细胞和活化树突状细胞）、促炎性 Th1 样 CD4⁺T 细胞和细胞因子相关通路更为丰富，但同时调节性 CD4⁺T 细胞和耗竭 CD8⁺T 细胞水平也有所升高，这表明 MSI 型的免疫景观较为复杂。TNFSF9 作为潜在的枢纽基因，在 MSI 型中上调，并且与 M1 巨噬细胞呈正相关，这凸显了其在塑造 MSI 特异性 TME 中的关键作用。然而，研究也存在一定的局限性，例如研究结果多为相关性，需要进一步实验验证因果机制；scRNA-seq 分析分辨率有限，可能无法完全捕捉罕见细胞群体和细微转录变化；未考虑患者异质性对免疫谱的影响；TNFSF9 在 MSI 中的作用机制还需要进一步探索。尽管如此，该研究依然为理解 MSI 型 STAD 的免疫反应和免疫治疗提供了新的视角，为后续的研究和临床治疗策略的优化奠定了重要基础，有望推动胃腺癌治疗领域的进一步发展。