一种快速高效的大肠杆菌多基因组合抑制策略：简化代谢调控新途径

《Microbial Cell Factories》：A rapid and efficient strategy for combinatorial repression of multiple genes in Escherichia coli

在代谢工程中，多基因表达调控至关重要，现有 CRISPRi 多基因调控构建众多单导向 RNA（sgRNA）表达质粒困难。研究人员开发组合抑制系统，优化多 sgRNA 表达，以 N - 乙酰神经氨酸（NeuAc）合成验证，简化多基因调控，助力工程菌株代谢流微调。

　　在代谢工程的奇妙世界里，细胞内的生化反应就像一场永不停歇的盛大狂欢，无数反应交织形成复杂的代谢网络。为了生产特定的化合物，精准调控代谢流成为关键。这就好比要在狂欢中引导人群流向特定方向，而多基因调控就是那关键的指挥棒。

CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列 / CRISPR 相关蛋白）系统改造而来的 CRISPR 干扰（CRISPRi）技术，成为了调控基因转录的有力工具。它依靠单导向 RNA（sgRNA）引导无催化活性的 Cas 蛋白结合特定 DNA 位点，从而抑制基因转录。通过表达多个 sgRNA，CRISPRi 能同时调控复杂代谢途径中的多个关键基因，在众多研究中大放异彩。比如，Yin 等人开发的基于 CRISPR/dCpf1 的双功能调控系统，能双向调控谷氨酸棒杆菌中多个基因的表达，使菌株的莽草酸产量大幅提升；Kim 等人在大肠杆菌中通过 CRISPRi 抑制相关基因，提高了异戊二醇的产量；Fang 等人在酿酒酵母中抑制特定基因，增加了 2 - 苯乙醇的产量。

然而，当前多基因抑制的方法存在一个大问题。主要依赖构建 sgRNA 阵列来同时表达多个 sgRNA，这意味着需要构建大量的 sgRNA 表达质粒来筛选最佳的多基因抑制组合，既耗时又费力。就像在一堆复杂的钥匙中寻找能打开多把锁的最佳组合，效率极低。例如，Chu 等人优化二肉桂酰甲烷的生物合成时，构建了多达 11 个 sgRNA 质粒，即便如此，评估所有可能的抑制组合仍需构建 25 个不同的 sgRNA 表达质粒。同时，使用多个诱导型启动子独立控制不同基因表达在合成生物学中已较为常见，但将其应用于 CRISPRi 来抑制多基因的研究尚未见报道。

为了解决这些问题，山东大学微生物技术国家重点实验室的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们构建了一种基于 CRISPRi 和正交诱导型启动子的高效多基因组合抑制系统，优化了三个具有低背景泄漏和高正交性的诱导型启动子，用于表达针对相应基因的不同 sgRNA。通过添加不同诱导剂，可独立调控这些基因的表达水平，避免了构建大量 sgRNA 质粒的繁琐过程。研究人员还优化了诱导型启动子和 sgRNA 柄序列，开发出三 sgRNA 组合表达质粒 p3gRNA-LTA，并改进了 Golden Gate Assembly 方法，能快速替换该质粒上的 sgRNA 靶向序列。最终，他们以 N - 乙酰神经氨酸（NeuAc）的生产为例，验证了该系统的便捷性。这一研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为代谢工程的多基因调控开辟了新道路。

在研究过程中，研究人员用到了几个主要关键的技术方法。首先是利用多种诱导型启动子分别控制不同 sgRNA 的表达，通过筛选确定合适的启动子。其次，采用改进的 Golden Gate Assembly 方法构建含有多个 sgRNA 的表达质粒。还运用了多种检测手段，如荧光强度检测、β- 半乳糖苷酶和 β- 葡萄糖醛酸酶活性测定，以及高效液相色谱（HPLC）分析代谢产物等。

下面来看具体的研究结果。

1. 筛选诱导型启动子：研究人员对 8 个候选诱导型启动子进行表征，发现PLuxB?、PCin?、PsalTTC?和PrhaBAD?启动子诱导表达强度高，但除PrhaBAD?外背景泄漏明显。PrhaBAD?、ParaBAD?、PLtetO?1?和PlacO1?背景泄漏低，且正交性良好。不过，葡萄糖会影响PrhaBAD?启动子的表达，最终选择PlacO1?、PLtetO?1?和ParaBAD?用于 sgRNA 序列表达。
2. 构建组合抑制系统：开发出高效的一步三 sgRNA 连接策略，成功构建初始三 sgRNA 表达质粒 p3gRNA-LTA。通过该方法，一次转化可获得大量转化子，测序验证多个克隆成功组装 sgRNA 序列。
3. 减少渗漏抑制：发现 sgRNA 的渗漏表达会导致基因抑制，通过修饰 sgRNA 柄序列调整其与 dCas9 的亲和力，筛选出能有效减少渗漏抑制的突变体。构建新的 p3gRNA-LTA，其在无诱导剂时基因表达影响小，诱导后能有效抑制基因表达，且 sgRNA 靶向序列位置和长度会影响基因抑制强度。
4. 表征多基因组合抑制系统：构建用于检测的大肠杆菌 MG1655RFP 菌株，用不同诱导剂处理后，各启动子表达的 sgRNA 能有效抑制相应基因，证明该系统可实现多基因组合抑制。
5. 优化 NeuAc 生物合成途径：利用组合抑制系统优化 NeuAc 生物合成途径，抑制与 PEP 消耗相关的基因后，NeuAc 产量变化显著。单独抑制 ptsI 时产量最高，多基因组合抑制效果存在差异，且抑制相关基因会影响发酵副产物浓度，而菌株的OD600?无明显变化。

在研究结论和讨论部分，研究人员构建的基于 CRISPRi 的高效多基因组合抑制系统，在优化 NeuAc 生物合成代谢流方面展现出重要价值。虽然组合抑制系统的抑制强度总体不如单 sgRNA 靶向位点，但相比无诱导剂时仍有显著抑制效果。最重要的是，使用诱导剂表达多个 sgRNA 靶向位点，大幅减少了组合抑制所需的 sgRNA 质粒数量，节省了人力和资源，还能根据细菌生长阶段灵活调整基因抑制强度。此外，研究人员还指出系统存在的潜在改进方向，如敲除参与阿拉伯糖代谢的 araBAD 基因以解决诱导不稳定问题，将基于 CRISPRa 的基因激活整合到系统中实现更多基因的组合调控，以及结合代谢物生物传感器建立全基因组 sgRNA 文库筛选最佳多基因调控组合等。这一研究成果为代谢工程领域的多基因调控提供了创新思路和实用方法，有望推动相关领域的进一步发展，在未来的生物制造和代谢工程应用中发挥重要作用。