共表达辅助基因增强蓝藻集胞藻 PCC 6803 中异源耐氧氢化酶活性：为生物燃料和生物产品开发开辟新途径

《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：Co-expression of auxiliary genes enhances the activity of a heterologous O2-tolerant hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803

为解决蓝藻中异源耐氧氢化酶（CnSH）活性低的问题，研究人员开展了优化 CnSH 多基因表达及共表达成熟酶基因的研究。结果显示，共表达辅助基因使 CnSH 活性提高 3 倍。这为利用蓝藻生产生物燃料和生物产品提供了新策略，具有重要意义。

　　在当今能源转型的大背景下，氢气（H2?）作为一种极具潜力的清洁能源，备受关注。它被视为未来循环经济的关键要素，在可再生能源领域意义重大。然而，当前H2?生产面临诸多困境，96% 的H2?生产仍依赖化石资源，开发可持续的H2?生产方式迫在眉睫。

自然界中，微生物为H2?生产提供了多样的途径，其中利用蓝藻进行光驱动H2?生产（photo-H2? ）备受瞩目。蓝藻拥有独特的光合作用系统，能从水氧化中获取电子，理论上可与H2?生产相耦合。不过，蓝藻自身的氢化酶存在O2?敏感性、H2?再氧化以及与其他代谢途径竞争电子等问题，严重限制了其在 photo-H2?生产中的应用。

为突破这些困境，研究人员将目光投向了耐氧氢化酶。此前，已成功将来自 Cupriavidus necator 的可溶性耐氧氢化酶（CnSH）引入蓝藻集胞藻 PCC 6803（Synechocystis sp. PCC 6803）中。尽管 CnSH 在有氧光合作用条件下具有活性，但其比活性较低，这意味着仍需进一步优化。

基于此，德国亥姆霍兹环境研究中心（Helmholtz Centre for Environmental Research-UFZ）的研究人员开展了深入研究。他们旨在提高 CnSH 在蓝藻中的活性，通过优化 CnSH 多基因表达以及共表达辅助基因，探索提升其性能的有效策略。研究成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，利用基于金门克隆（Golden Gate cloning）系统的模块化克隆策略构建载体，实现基因的精确组装；其次，运用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术分析转录本丰度，了解基因表达情况；此外，通过蛋白质免疫印迹（Western blot）、凝胶内活性染色以及体外H2?氧化活性测定等方法，对 CnSH 的表达和活性进行检测；最后，借助气相色谱（GC）技术测量体内H2?消耗情况。

下面来看具体的研究结果：

• 优化 hox 基因簇设计提高 CnSH 产量：研究人员设计了一种优化且可控的 hox 基因簇，选用了不同的遗传元件，如可被镍离子诱导的PnrsB?启动子、高效的合成核糖体结合位点（RBS*）以及转录终止子TpsbC? 。构建的菌株Syn_P_{nrsB}CnSHg和Syn_P_{nrsB}CnSHp分别通过基因组整合和质粒表达的方式进行 CnSH 表达。结果发现，与之前的菌株SynC?nSH相比，优化后的菌株中 CnSH 的合成和比活性显著提高，最高可达 1.8 倍。
• 引入 C. necator 成熟系统进一步提升 CnSH 活性：C. necator 的成熟系统由 7 个辅助成熟酶（Hyp 蛋白）组成，对氢化酶的组装和成熟至关重要。研究人员将编码这些成熟酶的基因在菌株Syn_P_{nrsB}CnSHg中进行共表达，测试了 3 种不同的启动子：来自大肠杆菌的鼠李糖诱导型启动子PrhaBAD? 、蓝藻中依赖镍离子的PnrsB?以及光调控的PpsbA2? 。结果表明，共表达辅助基因对 CnSH 的比活性有积极影响。例如，菌株+pPrhaBAD?CnHyp在低水平诱导（0.1 mM 鼠李糖）时，CnSH 活性提高了 60% ；而在 2 mM 鼠李糖诱导时，虽然活性有所下降，但仍比无质粒的菌株高。
• 体内H2?氧化活性与体外酶活性相关：研究人员通过监测光合活性细胞中H2?的消耗情况，探究了 CnSH 在体内的活性。结果显示，优化诱导后的Syn_P_{nrsB}CnSHg在体内的活性比SynC?nSH高 1.8 - 2 倍。提供质粒pPrhaBAD?CnHyp （无论是否诱导）以及pPnrsB?CnHyp进一步促进了H2?氧化活性，最高可达 32 UgCDW?1? 。

研究结论和讨论部分指出，通过两步策略，即优化表达系统和引入 C. necator 的 hyp 操纵子，使 CnSH 在蓝藻中的活性提高了 3.1 倍，达到了与异养宿主相似的水平。这一成果为 CnSH 在蓝藻中的广泛应用奠定了基础，如用于 photo-H2?生产或利用H2?促进生长和生物转化反应。同时，研究还发现，氢化酶和成熟酶基因表达的精细平衡对实现功能性 CnSH 的最大化生产至关重要。未来，还需进一步探索更有效的基因工具，以增强和控制异源基因的表达，优化 CnSH 在蓝藻中的生产。