磷酸酶UBLCP1调控弓形虫生长、毒力及线粒体完整性的机制研究及其疫苗开发潜力

《Parasites & Vectors》：Phosphatase UBLCP1 is required for the growth, virulence and mitochondrial integrity of Toxoplasma gondii

本期推荐：浙江大学团队针对弓形虫治疗靶点匮乏的现状，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建UBLCP1缺失株，发现该磷酸酶通过调控线粒体形态功能（维持△Ψm膜电位和ATP生成）及细胞周期相关蛋白（如IMC、AP2转录因子）的磷酸化状态，影响寄生虫入侵、复制等关键生物学过程。动物实验证实△UBLCP1突变株毒力显著减弱，并能诱导交叉保护性免疫，为抗弓形虫药物和疫苗研发提供了新靶点。

　　

弓形虫（Toxoplasma gondii）作为专性细胞内寄生的顶复门原虫，能感染几乎所有温血动物，全球约三分之一人群携带该病原体。这种"完美寄生虫"具有复杂生活史，其中速殖子阶段通过"入侵-复制-逸出"的裂解循环导致组织损伤，在免疫缺陷患者中引发脑炎、心肌炎等致命并发症。当前临床治疗主要依赖乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联用方案，但存在严重副作用且对慢性感染无效，更缺乏有效疫苗。面对这一公共卫生挑战，科学家将目光投向寄生虫特有的细胞器——线粒体，因其在能量代谢、氧化还原等关键生理过程中扮演核心角色，且与哺乳动物线粒体存在显著形态差异（如"套索状"单线粒体结构），成为理想的干预靶点。

浙江大学动物科学学院预防兽医研究所的马光旭（Guangxu Ma）和杜爱芳（Aifang Du）团队在《Parasites 》发表重要研究成果，首次揭示磷酸酶UBLCP1（ubiquitin-like domain-containing C-terminal domain phosphatase 1）通过维持线粒体结构和功能完整性，调控弓形虫速殖子的生长增殖与致病力。研究团队通过构建UBLCP1条件敲除株，结合磷酸化蛋白质组学、超高分辨率显微成像等技术，系统解析了该分子在寄生虫生命周期中的多重功能，并评估其作为减毒活疫苗的潜力。

关键技术方法包括：1）利用CRISPR-Cas9系统构建UBLCP1基因敲除（△UBLCP1）和回补（::UBLCP1）虫株；2）通过免疫荧光（IFA）和透射电镜（TEM）观察线粒体形态超微结构；3）采用JC-1染色和ATP检测评估线粒体膜电位（△Ψ_m）和能量代谢；4）基于TiO₂富集的磷酸化蛋白质组学分析差异磷酸化蛋白；5）建立ICR小鼠感染模型评估虫体毒力及免疫保护效果。

研究结果部分：

1. ?UBLCP1在弓形虫中的表达定位：通过过表达株p_Tubulin-UBLCP1-EGFP证实该蛋白同时定位于速殖子细胞核和胞质，且在细胞周期各阶段持续表达。

2. ?UBLCP1缺失抑制裂解生长：△UBLCP1虫株形成噬斑面积缩小83%（P<0.0001），宿主细胞入侵效率降低65%（P<0.0001）。延时观察显示96%纳虫泡（PV）仅含2个虫体（野生型通常含8-16个），提示复制严重受阻。

3. ?细胞周期调控异常：流式细胞术发现△UBLCP1虫群中sub-G₁期比例显著增加（提示DNA损伤），而G₀/G₁期减少38%（P<0.0001）。TUNEL检测证实10%虫体存在DNA断裂，导致内二分裂（endodyogeny）过程停滞。

4. ?线粒体结构与功能缺陷：免疫电镜显示突变株线粒体出现"厚膜"（TOM40标记外膜肿胀）和"球状塌陷"（HSP60标记基质凝聚）双重表型，嵴结构减少70%。功能上，ATP产量和△Ψ_m分别下降70%（P<0.01）和58%（P<0.001）。

5. ?磷酸化网络重塑：鉴定到1,260个上调（如IMC骨架蛋白）和1,139个下调（如CDPKs激酶）的磷酸化位点，主要富集于蛋白质周转（26%）、囊泡运输（18%）等通路。分子对接证实D⁴⁷⁰LDYT⁴⁷⁴是其催化活性中心。

6. ?动物模型验证：△UBLCP1虫株毒力完全衰减，接种10⁵个虫体仍不致死。预免疫小鼠可抵抗I型RH、II型PRU和III型VEG强毒株攻击，存活率达100%。

这项研究首次阐明UBLCP1通过双重机制调控弓形虫致病性：一方面作为"线粒体守护者"维持能量代谢稳态，另一方面通过去磷酸化修饰调控细胞周期关键因子。特别值得注意的是，△UBLCP1虫株展现出的跨株系保护效果，突破了传统减毒疫苗的血清型限制。研究者提出UBLCP1可作为"双效靶点"——其催化结构域适合小分子抑制剂开发，而全基因缺失株为活疫苗设计提供新思路。该成果不仅深化了对顶复门寄生虫细胞器演化的认知，更为抗弓形虫药物和疫苗研发提供了理论依据和实践路径。