综述：冷冻电镜揭示脂膜中成孔蛋白的孔道形成机制与结构特征

这篇综述系统梳理了细菌孔道形成毒素（PFTs）在宿主细胞膜上寡聚化及孔道形成的分子机制，重点比较了去垢剂、脂质纳米盘（nanodiscs）和脂质体三种研究体系的优劣。文章强调冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术在解析PFTs天然构象中的突破性作用，指出脂膜微环境对维持PFTs生理功能的关键意义，为开发靶向膜穿孔机制的抗菌策略提供新视角。

　　Abstract
病原细菌通过分泌孔道形成毒素（PFTs）这一独特可溶性单体蛋白武器库，精准靶向宿主细胞表面受体或脂质成分。这些两亲性毒素在膜上自发组装成跨膜孔道复合体，破坏质膜完整性进而瓦解宿主防御体系。尽管X射线晶体学和单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）已解析多种PFTs的原子结构，但传统去垢剂溶解体系可能扭曲其天然构象。最新研究表明，胆固醇等膜脂成分不仅能调节PFTs的膜结合特异性，还可通过改变膜曲率促进寡聚体形成。

Graphical abstract
冷冻电镜断层成像技术捕捉到脂质体中PFTs的动态寡聚过程：α-螺旋束先锚定于膜表面，β-发夹结构随后插入脂双层形成β-桶状孔道。引人注目的是，在天然脂膜环境中，某些PFTs会形成非经典七聚体构象，这与去垢剂体系中观察到的标准八聚体存在显著差异。

技术体系对比
去垢剂胶束虽便于获得高分辨率结构，但无法模拟真实的膜张力环境；脂质纳米盘能保持跨膜蛋白的天然取向，却受限于直径大小难以容纳大型寡聚体；而多层脂质体虽最接近生理状态，其结构异质性又给数据处理带来挑战。研究显示，气液界面法构建的巨型单层脂质体（GUVs）结合冷冻电子断层扫描，可直观呈现穿孔素（perforin）等PFTs引起的膜重塑过程。

结构功能关联
胆固醇依赖的细胞溶素（CDC）家族通过Thr-Leu富集结构域（L1-L3 loops）识别膜鞘脂，其寡聚体界面处的甘氨酸铰链允许构象重排；而葡萄球菌α-溶血素（α-HL）则利用"预孔状"中间体降低膜插入能垒。值得注意的是，脂质双层的物理特性（如疏水厚度）会显著影响孔道直径——当膜厚度增加1nm时，炭疽保护抗原（PA₆₃）孔道收缩率可达15%。

医学应用前景
针对PFTs膜穿孔机制的抑制剂设计迎来新突破：基于脂质体筛选平台发现的环肽化合物能特异性阻断肺炎链球菌溶素（PLY）的胆固醇结合域；而通过冷冻电镜解析的嗜水气单胞菌气溶素（AerA）过渡态结构，则为开发变构抑制剂提供精确靶点。未来，整合人工智能预测与原位结构生物学技术，有望揭示PFTs在真实感染场景中的全息作用图谱。