综述：推进海洋无脊椎动物细胞系研究：四个关键知识差距

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》：Advancing marine invertebrate cell line research: four key knowledge gaps

本文聚焦海洋无脊椎动物细胞培养，指出尽管其潜力巨大，但建立稳定细胞系困难重重。文章探讨了优化培养基、延长细胞干性、利用 “组学”（omics）技术和选择合适细胞类型这四个关键知识差距，为该领域研究提供了重要参考，值得一读。

　　一、海洋无脊椎动物细胞培养的研究现状与意义
海洋无脊椎动物细胞在体外培养具有极大潜力，在生物 / 环境研究、经济应用（如养殖海鲜）和医学研究等多领域意义重大，还能替代动物实验，推动生物技术创新和生理 / 代谢研究。无脊椎动物种类繁多，占动物物种的 95% 以上，其中海洋无脊椎动物占所有动物物种的 30 - 35%，它们提供了丰富多样的细胞和组织类型，具有显著的形态发生潜力，包括多能性、全能性甚至肿瘤样行为。

然而，细胞培养研究中哺乳动物占主导，97% 的可用细胞系来自哺乳动物，而海洋无脊椎动物细胞培养的研究虽已开展近六十年，却进展缓慢。研究主要集中于海绵动物（Porifera）、刺胞动物（Cnidaria）、甲壳动物（Crustacea）、软体动物（Mollusca）、棘皮动物（Echinodermata）和尾索动物（Urochordata）这六个海洋类群，致力于细胞分离和培养的基础技术开发。但除了近期海绵细胞系开发取得突破外，几乎所有建立稳定、长期细胞系的尝试均以失败告终，原因尚不明晰，且失败方法的相关记录较少，阻碍了该领域的发展。

二、海洋无脊椎动物细胞培养面临的关键知识差距

1. 培养基优化
   培养基是细胞系发展的基石。目前开发海洋无脊椎动物培养基的策略主要是优化市售（OTS）哺乳动物或昆虫细胞培养基，也有研究者尝试基于体内细胞外环境从头合成培养基，但效果不佳。培养基选择常基于他人经验，而非生物或细胞类型的特定营养需求。例如，对海绵细胞体外增殖和维持的营养需求了解有限，而对许多软体动物的渗透压、生长因子等需求虽有一定认识，却未充分应用于细胞系开发。

血清和抗生素在培养基中应用广泛。血清能提供生长因子等重要物质，但成分不确定，批次间存在差异；抗生素虽能控制部分污染物，但对单细胞真核寄生虫等无效，且无法应对病毒和支原体等潜在污染物。开发无抗生素细胞系对于海洋源药物的体外生产至关重要，同时严格的无菌技术和定期换液也不容忽视。

以海绵和被囊动物为例，海绵细胞培养基优化方法多样，如 Plackett–Burman 设计结合响应面法、一维搜索法和遗传算法（GAs）等。GAs 可优化多个参数，在海绵细胞培养基优化中优势明显，能在短时间内评估更多成分，已成功开发出多种培养基变体，提高了细胞代谢活性和增殖能力。被囊动物 Botryllus schlosseri 的研究探索了多种培养基配方对血细胞增殖的影响，为开发细胞类型特异性培养提供了希望。

2. 延长分离细胞的体外干性
   干性（Stemness）是干细胞的重要特征，在哺乳动物系统中，干细胞体外培养发展迅速，多种创新方法不断涌现。但在海洋无脊椎动物细胞培养中，应用干性技术仍处于早期阶段。许多海洋无脊椎动物的分离细胞在体外 24 - 72 小时内就停止分裂进入静止状态，建立永久细胞系困难重重，仅海绵细胞取得了一定突破。

海洋无脊椎动物拥有大量成体干细胞（MISC），对其维持、再生和无性繁殖至关重要，但 MISC 的鉴定、分离和表征面临诸多技术挑战，通常需要物种特异性方法和有效干细胞标记。目前仅有少数物种建立了分离干细胞的协议，利用转基因报告基因等方法具有一定潜力。

利用成体干细胞或借鉴哺乳动物诱导多能干细胞（iPS）技术等有望延长海洋无脊椎动物细胞的体外干性。虽然海洋无脊椎动物中存在与重编程相关的 Yamanaka 因子，但 iPS 技术在该领域的应用尚未开展。此外，细胞杂交和突变基因异位表达等方法也在探索之中。

3. 利用 “组学” 技术推进细胞培养技术
   在过去二十年，“组学” 技术在哺乳动物细胞培养和工程中发挥了重要作用，能深入了解细胞机制和途径，推动细胞培养优化和生物工艺设计。但在海洋无脊椎动物细胞培养中，“组学” 技术应用存在显著知识差距。

尽管新一代测序技术发展迅速，有助于表征海洋无脊椎动物的干细胞样细胞，但 “组学” 数据在几乎所有海洋无脊椎动物类群中的广泛可及性仍不足。目前 “组学” 研究多集中于海洋无脊椎动物的整体生物水平，针对其原代细胞培养开发的研究较少。

不过，已有一些有前景的研究。例如，Tsuchiya 等人对斑节对虾（Marsupenaeus japonicus）原代淋巴细胞进行转录组分析，发现 VEGF3 及其受体的表达变化，为优化培养基提供了依据；还有研究通过 “组学” 技术评估重金属对双壳类血细胞的影响、纳米颗粒对双壳类组织的毒性等，为体外生态毒理学模型开发提供了参考。

4. 选择适合体外培养的细胞类型
   选择合适的物种和细胞类型对建立细胞系至关重要。由于海洋无脊椎动物细胞培养的培养基具有物种特异性，若研究目标是开发特定应用的原代培养或细胞系，物种和细胞类型的选择可能影响长期培养的成功。若使用 “模式物种” 细胞增殖失败，可尝试其他相关物种的细胞。

细胞类型选择可基于细胞的假定干性、培养目的和细胞谱系等。例如，海绵细胞无真正胚层且能转分化，细胞谱系难以表征；对于短期研究，原代细胞培养可能就足以满足需求，优化培养变量需根据研究假设进行。

细胞来源（胚胎、幼虫、幼体或成体）也很关键。若要分离干细胞，胚胎或幼虫是较好选择，但获取某些物种的胚胎或幼虫可能存在困难。传统上，海洋无脊椎动物细胞培养多以组织、器官或整个生物体为细胞来源，不同类群细胞的行为存在差异。在开发培养肉的研究中，从龙虾尾肌分离成体肌肉干细胞取得了一定成功，同时也在探索从非致死来源建立具有增殖和肌源性潜力的永生细胞系，造血干细胞是有前景的来源之一。

三、总结与展望
海洋无脊椎动物细胞培养面临诸多挑战，细胞在体外迅速进入静止状态的原因尚不清楚，建立长期增殖细胞系的失败原因也有待深入研究。优化培养基、延长细胞干性、利用 “组学” 技术和选择合适细胞类型这四个关键知识差距是推进该领域发展的关键。

未来研究需要采用针对特定物种或细胞类型的整体研究方法，加强不同实验室间的合作。同时，应重视失败方法的记录和分享，避免重复劳动。随着研究的深入，有望突破现有瓶颈，充分发挥海洋无脊椎动物细胞培养的潜力，为多个领域的发展提供有力支持。